抗体简介课件

第一节概述

1．抗体

能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。

2．抗体产生过程3．抗体--丙种球蛋白

第三章抗体制药

1937年Tiselius用电泳法将血清蛋白

白蛋白

甲种（）球蛋白乙种（）球蛋白丙种（）球蛋白

并证明抗体活性主要存在于丙种球蛋白组分中（泳动速度最快）。

丙种球蛋白--抗体

研究发现病人血清中含有同抗体分子结构类似的球蛋白，统称为免疫球蛋白(Immunoglobulin,Ig).1）Ig是化学结构上的概念（结构与抗体相似）2）抗体是生物学上功能的概念（与抗原反应）3）所有抗体均是Ig（抗体---球蛋白Ig）4）并非所有Ig分子都具有抗体活性（结构与抗体相似，但未必能与抗原结合）。5．单克隆抗体

一个抗原含有多个抗原决定族

例细菌：鞭毛、细胞壁多糖等。

血清中会产生多种抗体---多克隆

临床诊断试验必须用单价血清（否则会发生非特异交叉反应），需要进行多次的吸收实验（不要的抗体被吸收）。

1975年Kohlker和Milstein等人首次利用B淋巴细胞杂交瘤技术制备出单克隆抗体（monoclonalantibody，McAb）。6．抗体制药的应用

1890年发现了白喉抗毒素（外毒素），并建立了血清疗效，开创了抗体制药领域。

1975年单克隆抗体的问世，使抗体作为疾病的诊断和治疗的应用范围有了很大的扩展。

第二节单克隆抗体2.1概念单克隆抗体将抗体产生细胞与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞相融合，通过有限稀释及克隆化，使杂交瘤细胞成为纯一的单克隆细胞系而产生的抗体。一个B细胞只能产生一种抗体一个B细胞只能与一个杂交瘤细胞融合2.细胞系与动物

1）免疫动物品系和骨髓瘤细胞在种系发生上距离越远，产生的杂交瘤越不稳定。

例小鼠（BALB/c）骨髓瘤细胞用抗原免疫动物最好也用小鼠（BALB/c）2）免疫应答能力

要选择对抗原免疫应答强的动物品系。

1.杂交瘤细胞选择融合率，自身不分泌抗体，融合细胞稳定性好。

2.在选择培养基上（HAT）进行融合细胞的筛选

H：次黄嘌呤，A：氨基喋呤（阻断DNA合成），T：胸腺嘧啶例：次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）骨髓瘤细胞（SP2/0）：为（HGPRT）阴性（缺陷）细胞株脾细胞：为（HGPRT）阳性细胞株

脾----脾增殖生长，死亡。

脾----瘤生长

瘤----瘤不能生长

瘤

不能生长

脾

生长，死亡。设计原理2．4筛选阳性克隆与克隆化

产生特定抗体的细胞只占所有脾细胞的5%,筛选工作量很大（上清的抗体活性）。

常用的方法1．免疫酶技术：可溶性或颗粒性抗原，简便、大批样本。2．免疫荧光技术：颗粒性抗原（细胞）的检测。3．放射免疫技术：可溶性或颗粒性抗原，灵敏。

例ELISA方法筛选阳性克隆克隆化

指单个细胞通过无性繁殖而获得细胞集团的整个培养过程。这种细胞集团的每个细胞的生物学特性和功能完全相同。

融合的杂交瘤细胞，需约3次克隆化，达抗体阳性细胞克隆为100%。（经稀释，每个孔在理论上只含一个细胞）

克隆化方法

有限稀释法和软琼脂法。

1．体外培养法

产量10g/ml,Ab

2．动物体内培养法

产量5-20mg/ml,Ab

杂交瘤细胞的两个亲本均来源于BALB/c小鼠，可选用BALB/c小鼠来制备单克隆抗体。2．6单克隆抗体大量制备

不同类或亚类的抗体纯化方式不同1

体外诊断试剂

IgG：沉淀+亲和层析（亲和力强）

IgM：沉淀+凝胶过滤（分子量最大Mr=90万）2

体内诊断试剂或治疗用药

A；去除内毒素、病毒、核酸等的污染物。

B．亲和层析和离子交换层析

2．7单克隆抗体纯化

动物体内诱生法制备单克隆抗体的纯化方法

互补决定区（CDR）

抗体分子和抗原分子发生特异性结合的关键部位。

Ig分子中参与构成抗原结合部位的是V区中三个CDR区，其它为框架区。

3．2

改形抗体保留鼠源性单克隆抗体的CDR区结构，抗体活性保持；CDR区以外的其它部分存在与否都不会影响抗体活性。

例用鼠源性单克隆抗体的CDR序列，替换人Ig分子中的CDR区，可使人的Ig分子具有鼠源性单克隆抗体的抗原结合特异性。在这种抗体分子中鼠源部分只占很小的比例，可基本消除免疫原性，称之为改形抗体或CDR移植抗体。

基因工程小分子抗体仅表达鼠源性单克隆抗体的V区，其片段相对分子质量仅为原抗体的1/80---1/3。

例:最小的只表达CDR区,Ig分子的C区不表达。

3．3

小分子抗体

1、Fab片段抗体

完整的轻链（VL+CL）和重链（VH+CH1）

---组成小分子抗体有以下几种

2

FV抗体

VH+VL组成，天然FV片段中VH和VL为非共价结合。3

单链抗体(SCFV)

VH+VL组成，但VH和VL通过一段连接肽，连接而成的重组蛋白。4

单域抗体

由VH（或VL）单个可变区组成，只有抗体分子1/12，表面疏水性强。一般认为在抗原结合部位VH比VL的作用更大。5

最小识别单位（MRU）

由单个CDR区构成的小分子抗体。仍具有与抗原结合的能力。但亲和力极低。

就是双特异性抗体。它是一种非天然性抗体，其结合抗原的两个臂具有不同的特异性。三种构建方法

1．化学交联法

化学试剂随机交联两个Ig分子表面上的巯基，

构建出双功能抗体。

优点：快速、简便、高效。

缺点：定位性差、稳定性差、无连续性。

3．4

双功能抗体

2．生物学方法

优点：具有严格的Ig结构和功能，有连续性。

缺点：构建过程复杂、周期长、产率低、

纯化技术复杂、不稳定。

3．基因工程方法

把两个抗原结合特异性不同的Fab片段，通过二硫键连接起来，形成一种双功能抗体。

构建抗体融合蛋白的原则

第一个蛋白的终止子密码子删除（特异性抗体），再接上带终止子密码子的第二个蛋白基因，即实现两个基因共表达。

3．5

抗体融合蛋白

例生物导弹优点：抗体融合蛋白能特异定位于肿瘤的局部，并输送高浓度的IL-2（高出6倍），减少IL-2对周身的副作用。

鼠源性抗体的改造，就是在保持其特异性抗原结合作用的前题下，尽可能的去除不利部分（免疫原性）。第四节基因工程抗体和抗体工程

4．1抗体研究领域的发展

分三个阶段1890年Behring白喉抗毒素的发现

特点：用抗原免疫动物获得多克隆抗体1975年Kohler创建杂交瘤技术

特点：制备出单克隆抗体1994年Winter基因工程法制备抗体

特点：不用免疫动物和细胞融合技术，就可制备抗体。过程：不同的VH或VL基因重组，得到无数种抗体。抗体文库可达到或超过1011库容,所以能包含B细胞全部克隆。

4．2噬菌体的抗体库构建抗体基因插入噬菌粒中,构成噬菌体抗体库。噬菌粒：具有噬菌体和质粒的共同特点。大容量、高效。例pHEN1特点：含有一个琥珀终止密码

E.coli(SupE+)：琥珀突变终止密码子抑制菌株

E.coli(SupE-)：非琥珀突变终止密码子抑制菌株

1．当噬菌粒感染E.coli(SupE+)

琥珀终止密码（UAG）被抑制，翻译出谷氨酸，抗体和噬菌体外壳蛋白以融合蛋白的形式表达在噬菌体的表面。

一般噬菌粒感染E.coli(SupE+)，使抗体蛋白在噬菌体表面，有利于鉴定。抗体基因插入噬菌粒中,构成噬菌体抗体库。2．当噬菌粒感染E.coli(SupE-)

琥珀终止密码（UAG）解抑制，翻译为终止密码子，外源抗体蛋白，以可溶性蛋白形式表达。

确定了目的克隆抗体后，就可再感染E.coli

(SupE-)的菌株，进行可溶性蛋白表达，用Westernblot分析确定，完成了文库构建的全过程。

Westernblot1．

抗体文库容量大，可达到或超过1011

2．

避开了人工免疫和杂交瘤技术3．

亲和力高

4．3

噬菌体抗体文库特点

1．原核细胞表达融合表达、分泌表达2．真核细胞表达分泌型表达3．转基因植物表达4．转基因动物表达

4．4基因工程抗体表达

第五节

抗体诊断试剂

概念--抗体反应特点

抗原抗体特异性结合，在体内或体外均可呈现某种反应。体内：溶菌、杀菌、促进吞噬、中和毒素（故抗体类药物可用于治疗）。体外：根据抗原特性，可发生凝集、沉淀反应

（故用已知抗体来鉴定抗原，用于血清学鉴定)。

5．1血清学鉴定用的抗体制剂

1、乙型肝炎病毒表面抗原(HbsAg)的反向被动血凝诊断制剂

主要用于病原菌和血型鉴定（凝集反应）

2、妊辰诊断制剂

凝集反应3、抗ABO血型系统血清制剂

特点：提高灵敏度，微量测定。

免疫荧光技术、免疫酶技术和放射免疫技术。

5．2免疫标记技术用的抗体制剂

1．荧光抗体诊断制剂

2．免疫酶抗体诊断制剂1）

免疫酶染色（组化法）

2）酶免疫测定（EIA）一种在液相内微量待检抗原物质的定量测定方法。

3．放射免疫用抗体诊断制剂

放射免疫技术：是把放射性核素分析的高度灵敏性与抗原抗体的特异性两大特点结合起来的技术。特点：灵敏度高，特异性强，能检测出ng/ml或pg/ml。

（酶标g/ml）5．3导向诊断药物

借助于放射性核素标记的抗体进行。

优点：1．在体内有确切定位肿瘤的作用，准确率为90%以上。2．体内可检测出0.5cm大小的病灶。3．小分子抗体容易到达肿瘤部位。4．抗体在肿瘤部位，可保留6-9天。5．能观察抗体在血中的半衰期和可能的不良反应。第六节抗体治疗药物

放射性核素131I、212Bi

优点

1）放射性核素标记的抗体有较大的杀伤范围

2）放射性核素标记的抗体分子量小，容易穿透到达肿瘤部位。

缺点

1）有些放射性核素来源困难。

2）需放射性保护。6．1放射性核素标记的抗体治疗药物

1．常用的抗癌药物

特点

1）体外实验证明，细胞毒性提高2倍。

2）抗体偶联药物对化疗有耐药性的菌株仍有效。

6．2抗癌药物偶联的抗体药物

1）

耐药性的产生

肿瘤细胞对药物可产生多种耐药性（MDR）。

MDR是由基因调控，基因编码一种P糖蛋白。

P糖蛋白是一种跨膜蛋白，在细胞内折叠成6对，形成通道样结构并在胞浆一侧有2个ATP结合区。

目前认为P糖蛋白是ATP酶依赖性的药泵

2．抗体类药物逆转耐药性

作用方式药物进入细胞，与P糖蛋白结合，然后在ATP酶的作用下，利用ATP水解释放能量将药物泵出胞外，使胞内药物蓄积减少，因而产生耐药性。

2）耐药性的克服1985年

首次制备出与MDR相关的单克隆抗体C219，可与P糖蛋白结合。1990年构建人—鼠嵌合抗体，MDR鼠的单克隆可变区加人Ig的C基因的结合，其效果强于单克隆抗体。

逆转的关键：

A

取决于抗体能否识别P糖蛋白膜外的表位。

B

取决于肿瘤是否有P糖蛋白的表达。

尽管抗体的逆转作用特异性强，但无直接的杀伤肿瘤细胞的作用，必须要与抗癌药物偶联，才能对肿瘤细胞有毒性作用。1．免疫毒素及其换代制品

在导向药物中，毒素和抗体的交联物称为免疫毒素。

第一代免疫毒素

A、B链完整毒素和抗体的交联物。

缺点：B链为非特异性结合，仅在体外有限使用。6．3毒素偶联的抗体药物第二代免疫毒素

抗体或抗体片段与毒素A链或与A链作用相似的单链核糖体失活蛋白的结合物。