DB15T 2741-2022间接ELISA方法检测羊溶血性曼氏杆菌抗体

ICS65.020.30CCSICS65.020.30CCSB41内蒙古自治区地方标准DB15/T2741—2022ELISA杆菌抗体IndirectELISAfordetectionofantibodyofsheepIndirectELISAfordetectionofantibodyofsheepmannheimiahaemolytica2022-07-292022-08-29内蒙古自治区市场监督管理局发布前 言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件由内蒙古自治区农牧业科学院提出。本文件由内蒙古畜牧业标准化技术委员会（SAM/TC19）归口。本文件主要起草单位：内蒙古自治区农牧业科学院。本文件主要起草人：张月梅、赵世华、宋越、白帆、王娜、戴伶俐、张帆、杨斌、刘威。间接ELISA方法检测羊溶血性曼氏杆菌抗体范围本文件规定了应用间接ELISA检测羊溶血性曼氏杆菌抗体的方法。本文件适用于羊溶血性曼氏杆菌PlpE蛋白抗体检测。本文件没有规范性引用文件。下列术语和定义适用于本文件。酶联免疫吸附试验enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA辣根过氧化物酶horseradishperoxidase，HRP（alkalinephosphatase，AKP）溶血性曼氏杆菌mannheimiahaemolytica，Mh巴氏杆菌科曼氏杆菌属的微生物，球杆状或短杆状菌，两端钝圆，革兰染色阴性，典型两端深染，中间浅，单个或成双存在，无鞭毛，有荚膜，不形成芽孢。3,3’,5,5’-四甲基联苯胺tetramethylbenzidine，TMB异丙基-β-D-硫代半乳糖苷isopropyl-β-d-thiogalactoside，IPTG一种作用极强的诱导剂，它可以作为具有lac或tac等启动子的表达载体的表达诱导物使用。吐温-20tween-20一种非离子型表面活性剂。卡那霉素kanamycin一种蛋白质生物合成抑制剂，从卡那霉素链霉菌（Streptomyceskanamyceticus）中分离得到。吸光度opticaldensity，OD表示被检测物吸收掉的光密度，是检测方法里的专有名词，检测单位用OD值表示。试剂PlpE分离鉴定并经测序确定为溶血性曼氏杆菌的菌液制备全菌灭活抗原，并用其免疫3月龄羔羊制备标准阳性血清，经间接血凝实验验证为阳性。阴性血清无母源抗体，经间接血凝实验结果为阴性。酶结合物HRP标记的抗羊IgG抗体，工作浓度参照所购产品说明书。称取碳酸钠1.0g和碳酸氢钠3.0g，溶于800mL超纯水，调节pH值为9.4～9.6，用超纯水定容至1000mL。称取磷酸二氢钾0.24g，磷酸氢二钠1.42g，氯化钠8.0g，氯化钾0.2g，超纯水800mL溶解后，调整pH值为7.4，超纯水定容至1000mL，121℃高压蒸汽灭菌15min。封闭液称取脱脂乳5.0g，溶于100mL磷酸盐缓冲液中。洗涤液向PBS溶液中添加0.05%Tween-20，即每1LPBS中添加500μLTween-20，混匀后室温保存。稀释液量取5.0mL马血清溶于95.0mLPBS中。A称取TMB200.0mg，无水乙醇（或二甲基亚砜）100mL，加超纯水至1000mL。底物液B14.609.33g，0.756.4pH5.0～5.4终止液量取5.6mL浓硫酸（18mol/L）与94.4mL超纯水混合，冷却至室温保存。TSA15.0g5.05.0g1000mL保存。TSB称取胰酪胨15.0g，大豆木瓜蛋白酶水解物5.0g，氯化钠5.0g，超纯水1000mL，混合，微热溶解，调节pH值为7.3，121℃高压蒸汽灭菌15min。制备好的培养基宜在2℃~8℃保存。LB10.0g5.0g10.0g1000mLpH值为7.3，121℃高压蒸汽灭菌15min。制备好的培养基宜在2℃~8℃保存。LB10.0保存。TSB称取胰酪胨15.0g，大豆木瓜蛋白酶水解物5.0g，氯化钠5.0g，超纯水1000mL，混合，微热溶解，调节pH值为7.3，121℃高压蒸汽灭菌15min。制备好的培养基宜在2℃~8℃保存。LB10.0g5.0g10.0g1000mLpH值为7.3，121℃高压蒸汽灭菌15min。制备好的培养基宜在2℃~8℃保存。LB10.0g5.0g10.0g1000mLpH值为15.0g1560求下倾注约20mL至无菌平皿中。加盖后在室温放至凝固。制备好的培养基宜在2℃~8℃保存。5仪器与设备恒温培养箱：37℃。酶标仪。0g~500g0.01g。37低温离心机。(10μL、200μL、1000μL(300μL)。（96U96。冰箱。(5mL，10mL)。6血清样本的处置42h2℃~8℃3后，4000r/min10min，用移血清样本若在一周内进行检测，可在冰箱中2℃~8℃保存，如果超过一周检测，应将样品置于-207方法包被抗原的制备5TSA35%TSB37℃培养12h~16DNADNA。（A）PlpEpET-28bNdeIXhoILB37LB随后对质粒进行双酶切、测序鉴定，确定成功构建PlpE-pET-28b原核表达载体。将含有质粒PlpE-pET-28b的大肠杆菌原核表达载体在含有终浓度为100μg/mL卡那霉素的LB固体37100μg/mLLB培养基中，371010g/mLB37℃OD600为0.6IPTG1mmol/L4h℃，离心20minμmBCAPlpEBCAWesternblotDABELISA检测0.05mol/L、pH9.6(CBS0.25μg/mL100µL/孔加入至酶联反应板，置4℃冰箱过夜，次日甩掉包被液，用PBST洗涤酶联反应板3次。300µL/371h；取PBST3PBS1:100100µL/孔，37℃恒温箱孵育1h，用PBST洗板3次。吸取不同血清时需要更换洗头。100µL/30ABTMB100µL/20min1mol/LH2SO4100µL/450nm2判定标准的确定在已经确定的间接ELISA条件下，对经间接血凝试验检测抗体阴性的20份羊血清，用重组PlpE抗原OD450+3s=0.411+2s=0.33S/P0.411S/P0.33疑似，S/P小于0.33时判定为阴性。S/P=(样品血清A值－阴性血清A值)/(阳性血清A值－阴性血清A值)附录A（资料性）溶血性曼氏杆菌PlpE基因的扩增溶血性曼氏杆菌