亲和层析技术在生物科学中的应用课件

亲和层析技术在生物科学中的应用

摘要

Abstract

最近几十年来．亲和层析技术发展十分迅速，广泛应用于生物分子(如结合蛋白、酶、抑制荆、抗原、抗体、激素、激素受体、糖蛋白、核酸及多糖类等)及组织(如细胞、细胞器、病毒等)的分离和纯化，是蛋白质组学研究中重要的技术之一．介绍了亲和层析的基本类型及配体舍成的研究进展，概述了亲和层析技术在蛋白质组学以及在其他方面的应用和发展动态。Thedevelopmentofaffinitychromatographytechniqueisveryfastinrecentyears，remarkableaccomplishmentshavebeenachievedintheseparationandpurificationofbiomoleculesandorganismsaswellasinstudyingtheinteractionsbetweenbiomolecules．Thecommonlyuseddifferentligandtypesandrecentprogressinsearchingforligandsaredemonstrated.Theapplicationofaffinitychromatographyinproteomicsandinotherareasareoutlined.关键字：亲和层析；蛋白质；纯化；鉴定

Keywords：Affinitychromatography;protein;cellulose;purification;identify

引言

亲和层析(affinitychromatography)是利用偶联亲和配体的亲和吸附介质为固定相亲和吸附目标产物。它具有很高的选择和分离性能以及较大的载量，只需要一步处理即可使某待分离的生物大分子从复杂的混合物中分离出来，达到千倍以上的纯化，并保持较高的活性，是分离纯化以及分析生物大分子尤其是蛋白质的有力工具。近几十年来，亲和层析技术发展十分迅速，并在生物技术产品、生物分子及组织的分离和纯化领域取得令人瞩目的成就．现已广泛用于分离纯化蛋白质、肽、酶及其底物和抑制剂、抗体及抗原、核酸及其特异性作用物、激素及受体、细胞及细胞表面物等等基于此，本文针对亲和层析的基本类型，配体的选择和亲和层析在生物学特别是蛋白质组学中的应用等方面作一介绍。1常规材亲和层析的类型

1.1材生物亲和层析(BAFC)生物亲和层析是利用自然界中存在的生物特异性相互作用物质对的亲和层析．通常具有高的选择性，典型的物质对有酶．底物、酶．抑制剂、激素．受体等．1.2免疫亲和层析(IAFC)

许多典型的亲和层析纯化蛋白质的过利用抗原抗体中的一方为配体，亲和吸附另一方的分离系统，称免疫亲和层析．免疫亲和层析应用相当广泛．许多亲和层析纯化蛋白质过程已经使用了单克隆抗体作为亲和配体．1.3金属螯合亲和层析(IMAC)

金属离子亲和层析是利用金属离子的络合物或形成螯合物的能力吸附蛋白质的分离系统．目的蛋白质表面暴露的供电子氨基酸残基。

1.4拟生物亲和层析(BiomimeticAFC)

拟生物亲和层析是利用部分分子相互作用，模拟生物分子结构或某特定部位．以人工合成的配基为固定相吸附目的蛋白质的亲和层析。

亲和层析是一种非常有效的大规模纯化生物技术产品的分级分离技术并已广泛应用于蛋白质组学和其他领域的研究．

尽管其具有很大潜力，但针对每个目标是否能得到适当的配体，亲和层析方法的利用是受到限制的．近年来发展的利用分子模型对配体进行设计和组合化学相结合以经成为一种为特定生物技术需求产生新颖而特异性强的配体的创新方法。2结亲和层析配体的设计及应用组合方法筛选配体

2.1亲和层析配体的设计

依据蛋白结构设计配体要考虑两个重要因素：第一正确地预计被设计的配体构像的能力；第二，正确预计配体的亲和力的能力．

1)符合一定要求的分子的形状．例如，线形带负电荷的分子肝磷脂对于纯化DNA—结合酶是一种常规方法¨，另外纯化核苷酸结合酶的配体三嗪染料CibacronBlue3GAt具备能与一些酶的核苷酸结合位点形成合适的相互作用所需的几何结构以及离子和疏水性的基团．2)配体具特异功能团．例如苯甲脒作为胰蛋白酶类蛋白酶的配体，羟氨基酸作为与金属结合的蛋白的配体．3)两个或数个已知的底物、抑制剂、效应体或辅助因子这样的结构模体的结合体衍生的结构模型。例如酮—羧基仿生物嵌合染料—配体被设计作为纯化识别(酮)羧基的酶的配体.2.2组合方法筛选配体

应用组合化学的方法建立多肽文库，然后利用多肽文库来筛选与目的蛋白特异性结合的多肽配基．这一观点的提出大大促进了亲和层析筛选及合成配基技术的发展．过去的十几年中已出现了允许产生多达1O种不同的蛋白，肽链或核酸文库的方法．这样的大文库使选择高亲和性和特异性的分子成为可能．

2.3出头设计配体

由于能将X射线晶体学，NMR或同源结构的知识与限定的或组合化学合成以及先进的计算机技术相结合，合理设计亲和配体变得更切实可行，有效，符合逻辑且更快．这种方法依赖于利用目标蛋白的结构信息有目的地集中引导配体的合成并使合成的努力限定朝向已经过实验评价能结合到被检测目标或预计能结合到目标的方向，该方法包括以下的步骤：

选择目标蛋白上合适的位点，设计与该位点的三维结构相配伍的配体，合成一个结构上相关联的固相的组合配体文库，并针对目标蛋白扫描这个文库针对IgG的非肽仿生物配体已经建立，它是依据蛋白A的B结构域和IgG的Fc片段组成的复合物的x射线晶体学结构获得的．利用计算机协助的分子模型，一系列围绕蛋白A双肽Phel32-Tyrl33的仿生物分子被设计出．其中一个这样的配体能与人类IgG结合，该配体在三嗪环上带有3-氨基苯酚和4氨基—1—萘酚部分．当这个仿生物配体被固定到琼脂糖上被成功地用于纯化人类血浆的IgG．为重组胰岛索前体MI3以及重组人类凝固因子VIIa等而设计的仿生物学配体的类似方法也已建立．3结亲和层析的应用

3.1亲和层析在蛋白质组学中的应用

蛋白质组学最常用的实验技术是用于分离蛋白的双相电泳(2-DE)和用于鉴定被分离蛋白的质谱(MS)技术．然而亲和层析也是起很大作用的分离方法．蛋白被2-DE分离前亲和层析主要被用作选择性地预先浓缩和预处理样品．其应用包括去除一种或一类会干扰2-DE的分辨率的蛋白，一个典型的例子是血清及脑脊髓液样品的白蛋白和免疫球蛋白IgG的去除，是通过吸附在亲和树脂上的方法进行的，这样可显著提高2-DE胶上蛋白斑点的分辨率．另外，亲和层析可浓缩低丰度的蛋白，这样它们就可在2-DE胶上被看到；还可将所有蛋白分类成两组或几组以便进一步分析。3.2分离纯化目的蛋白、定量测定

近年来，高速发展的生物制药工业已广泛应用亲和层析技术作为其重要的分离纯化和定量测定用于临床药物的工具．亲和层析最常用于靶标蛋白尤其是疫苗的分离纯化上．特别在融合蛋白的分离纯化上，亲和层析更是起到举足轻重的作用，因为融合蛋白具有特异性结合能力．亲和层析在基因工程亚单位疫苗的分离纯化中应用相当广泛，其中，以对分别带有(His)和GST亲和标记的融合蛋白的抗原Ni-NAT和GST亲和层析应用相当广泛．金属螯和层析与免疫亲和层析也得到一定的应用．3.3生物分子间相互作用的鉴定

亲和层析也被用来研究生物系统中生物分子间发生的相互作用,该领域已被用来检验各种生物系统,包括凝集素lectin／糖,酶／抑制剂,蛋白／蛋白,以及DNA／蛋白间的相互作用,临床上主要将该技术用于研究药或激素与血清蛋白间的结合,两种层析方法可用来研究生物间相互作用.

3.4亲和层析与其他分析技术相结合近年来的另一发展趋势是寻求更加优化的系统设计和安排形式，从而获得快速、优良的选择性以及很大数量被检测的样品．亲和层析与其他分析技术串联结合即可很好地达到这一目的．目前已经有很多成功运用亲和层析(AFC)．MS、AFC，HPLC、AFC．HPLC．MS、AFC．CE(毛细管电泳)等串联结合的应用．这种结合因其不可替代的优点，仍将继续发展.4结论

在发现和生产治疗疾病的蛋白方面的挑战已经使人们有必要重新考虑设计和进行纯化的过程，这种选择主要是由方法的引进速度,有效性,稳定性和经济承受能力决定的.传统的纯化规程正被高度选择