动物细胞工程ppt参考课件

动物细胞工程专题2细胞工程动物细胞工程细胞核移植动物细胞培养单克隆抗体制备技术手段二.动物细胞工程基础动物细胞融合植物细胞工程常用的技术手段有哪些？植物组织培养,植物体细胞杂交一、动物细胞培养一.动物细胞的培养过程

幼龄动物取动物器官和组织剪碎组织胰蛋白酶处理原代培养单个细胞传代培养分装动物胚胎或幼龄动物的组织、器官细胞悬浮液剪碎10代细胞（第一次危机）50代细胞（第二次危机）细胞株不死性细胞细胞系培养瓶(皿)中培养癌变分离细胞大多数衰老死亡（遗传物质未改变）死亡细胞（遗传物质已改变）胰蛋白酶胰蛋白酶原代培养传代培养动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，将细胞网络起来形成具有一定弹性和韧性的组织和器官。3、流程表面光滑、无毒、易于贴附胃蛋白酶可否？胰蛋白酶——分解弹性纤维蛋白二.相关概念1、非致死细胞、致死细胞——根据细胞的寿命非致死细胞：在体外培养基中不断增殖，数目以指数式形式增加，当细胞密度达到一定程度时，细胞停止分裂，不再生长。但当被放到新鲜培养基中，细胞重新生长。这样可以连续传代。这种细胞包括癌细胞、表皮细胞和成纤维细胞。致死细胞：能在体外生存和增殖，但不能连续传代，往往分裂几代或几十代后就会死亡。大多数细胞属于这类细胞。2.接触抑制

贴壁细胞进行有丝分裂，数量不断增多，当它们分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。3.原代培养直接从机体取下细胞、组织和器官后立即进行培养（严格来说，指成功传代之前的培养）。实际上，通常把第1代至第10

代以内的培养细胞统称原代细胞培养。4.传代培养将原代细胞从培养瓶中取出，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养，称为传代培养。传代代数：二.相关概念5.细胞株+细胞系细胞株：原代细胞一般传至10代左右细胞生长停滞，大部分细胞衰老死亡，少数细胞存活到40至50代，这种传代细胞为细胞株。细胞系：细胞株传代至50代后又出现细胞生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，使其在培养条件下可以无限制传代，这种传代细胞为细胞系。细胞株和细胞系的区别：细胞系的遗传物质改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，容易传代培养。三.培养条件1.营养:糖,氨基酸,促生长因子,无机盐,微量元素等,血清（为什么添加?）2.无菌、无毒的环境，如培养细胞和培养皿的消毒，添加维生素,定期更换培养基等。3.温度和pH值，一般为36.5+0.5度为宜，最适pH值为7.2至7.4。4.气体，（95%空气和5%CO2

）

O2是代谢所必需,CO2主要是为了维持培养液的pH值。四.动物细胞培养的应用

1.生产许多有重要价值的蛋白质生物制品，如病毒疫苗、干扰素、克隆抗体等，都可以借助于动物细胞的大规模培养来生产。2.基因工程技术中的应用（提供受体细胞）3.用于检测有毒物质，判断某种物质的毒性。4.医学家培养各种正常的或病变的细胞，用于生理、病理、药理等方面的研究，为治疗和预防疾病提供理论依据。五.植物组织培养和动物细胞培养的比较比较项目植物组织培养动物细胞培养原理培养基性质培养基特有成分培养结果培养目的细胞的全能性细胞有丝分裂固体培养基液体培养基蔗糖植物激素葡萄糖动物血清细胞株、细胞系植物体快速繁殖、培育无病毒植株获得细胞或细胞分泌蛋白思考：2、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细胞培养材料？1、动物细胞培养液的主要成分是什么？较植物组培培养基有何独特之处？3、为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？4、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养最终培养成新个体主要成分：葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等。独特之处有：1、液体培养基2、成分中有动物血清等因为这些组织或器官上的细胞生命力旺盛，分裂能力强成块组织不利培养，分散了做成细胞悬浮液利于培养不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新的动物个体动物体细胞核移植技术和克隆动物一.克隆概念克隆(clone)是指一个共同的祖先，通过无性繁殖的方法产生一组遗传上完全相同的DNA、细胞或个体。

供体体细胞细胞核＋受体去核卵细胞的细胞借助于卵细胞质对体细胞核的发育功能起着关键性的调节作用发育成胚胎克隆动物重组细胞动物的一个细胞的细胞核移入一个已去细胞核的卵母细胞中,使其重组并发育成一个新的胚胎,最终发育成动物个体1、概念二.细胞体细胞核移植技术与动物克隆胚胎细胞核移植:分化程度低恢复全能性容易体细胞核移植,分化程度高,恢复其全能性困难芬兰多赛特白羊苏格兰黑面母绵羊核供体（A）羊卵供体（B）羊乳腺细胞饥饿培养去核电融合新的卵细胞桑椹胚或囊胚代孕母羊（C）羊多莉证明了动物细胞核具有全能性1：培育出来的克隆牛性状与谁相似？百分百相似吗？三.克隆大事记1938年：德国科学家首次提出克隆设想。

1952年：科学家开始用青蛙进行克隆实验。

1970年：克隆青蛙实验取得突破，青蛙卵发育成了蝌蚪，但是在开始进食以后死亡。

1981年：科学家进行克隆鼠实验，据称用鼠胚胎细胞培育出了正常的鼠。

1984年：第一只胚胎克隆羊诞生。

1997年2月24日：英国罗斯林研究所宣布克隆羊培育成功。科学家用取自一只6岁成年羊的乳腺细胞培育成功一只克隆羊。

1998年2月23日：英国PPL医疗公司宣布，该公司克隆出一头牛犊“杰弗逊先生”。

1998年7月5日：日本科学家宣布，他们利用成年动物体细胞克隆的两头牛犊诞生。三.克隆大事记1998年7月22日：科学家采用一种新克隆技术，用成年鼠的体细胞成功地培育出了第三代共50多只克隆鼠，这是人类第一次用克隆动物克隆出克隆动物。

1999年5月31日：美国夏威夷大学的科学家，利用成年体细胞克隆出第一只雄性老鼠。

1999年6月17日：以美藉华人科学家杨向中为首的研究小组利用一头13岁高龄的母牛耳朵上取出的细胞克隆出小牛。

2000年1月3日：美国著名华人杨向东，用体外长期培养后的公牛耳皮细胞成功克隆出6头牛犊。2000年1月：美国科学家宣布克隆猴成功，这只恒河猴被命名“泰特拉”。

2000年3月14日：曾参与克隆小羊“多利”的英国PPL公司宣布，他们成功培育出5头克隆猪。四.体细胞核移植技术的应用前景体细胞核移植技术已展示出广阔的应用前景，概括起来大致有以下四个方面：（2）生产转基因动物；（4）复制濒危的动物物种，保存和传播动物物种资源（3）生产人胚胎干细胞经过诱导分化形成相应组织、器官用于器官移植；

（1）培育优良畜种和生产实验动物。动物克隆的展望电影《第六日》片段《时代》封面故事“争论克隆人”2001年11月美科学家宣布首次克隆处于早期阶段的人类胚胎

图为冒死也要克隆人的科学家布瓦瑟利耶五.体细胞核移植技术存在的问题成功率比较低，产下活克隆动物占移植的胚胎平均不到10%克隆技术的各个环节有待进一步改进健康问题:畸形率高,死亡率高,易出现早衰。伦理、食品安全等问题也是目前人们争论的焦点。克隆动物基因组重新编程的机制尚不清楚费用昂贵,距大规模应用还有一段距离克隆技术的弊端六.尚待解决的伦理难题1、人类在制造生命的同时又在毁灭生命。如果以获取胚胎干细胞为目的来克隆人类胚胎，那么，人类在获取干细胞的同时也就破坏了这个胚胎，而胚胎本身已经具有了生命的特征，可看作是一个生命。2、克隆人的出现对人类意味着什么？人类必须对这个问题进行更深层次的思考。禁止生殖性克隆人。坚持四不原则：不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人的实验。但是，中国不反对治疗性克隆人。中国政府的态度：说说我的看法你支持克隆人胚胎（治疗性克隆）研究吗？你愿意被科学家克隆吗？你支持克隆人（生殖性克隆）吗？如果有一天克隆人真的来了，我们该怎么办？你怎么看？动物细胞融合

细胞融合是正常的生命活动两个细胞正在融合

受精作用思考下列问题：1、什么叫动物细胞融合？植物体杂交技术与动物细胞融合有什么不同呢？2、动物细胞在结构上有何区别？这与它们杂交或融合过程有什么影响？3、动物细胞融合与植物原生质体融合的基本原理是否相同？两者的融合过程是否也一样？2、基本原理生物膜的流动性3、诱导融合的方法

动物细胞融合也称细胞杂交，指用自然或人工方法、使两个或多个不同的细胞融合成一个细胞的过程杂交细胞：融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞，称为杂交细胞。1、概念化学：PEG（聚乙二醇）物理：电融合生物：灭活的病毒仙台病毒疱疹病毒新城鸡瘟病毒丧失感染性、保留其的抗原性（诱导细胞融合）诱导细胞融合：筛选、克隆杂合细胞4、技术流程杂交细胞灭火病毒诱导过程灭活的病毒颗粒黏附于细胞表面细胞膜被病毒颗粒穿透4、优点：突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交成为可能四、单克隆抗体克隆:单个细胞无性繁殖单:抗体:单克隆抗体

用单个效应B细胞进行无性增殖（扩增），也就是通过克隆，形成细胞群，这样的细胞群就有可能产生出化学性质单一、特异性强的抗体——单克隆抗体是机体受抗原刺激后产生的、并能与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。效应B淋巴细胞产生抗体。一般抗原刺激机体会产生多种抗体1、机体如何产生抗体？2、抗体主要存在部位？4、获得的抗体产量高吗？特异性强吗？纯度高吗？为什么？5、如何获得某种特异性强的单一抗体(单克隆抗体）？6、用某种效应B细胞能否大量制备此单克隆抗体？为什么3、从何处提取、分离抗体？外来抗原刺激机体，从而发生特异性免疫反应、产生抗体血清腹水等内环境从动物血清或腹水中提取同种抗原刺激，体内的B细胞可以产生多达百万种以上的特异性抗体，一种抗原存在不同的抗原决定簇得到分泌此抗体的效应B细胞不能、效应B细胞无增殖能力、10天左右死亡7、如何大量制备？赋予此效应B细胞无限增殖能力如何赋予无限增殖能力利用淋巴细胞产生抗体的功能利用肿瘤细胞无限增殖的特性利用细胞融合的技术将两种细胞融合获得具有淋巴细胞和肿瘤细胞特性的杂交瘤细胞利用动物细胞培养技术大量培养杂交瘤细胞1、单克隆抗体的制备效应B细胞骨髓瘤细胞诱导细胞融合未融合、融合细胞群筛选能产生某专一特定抗体的细胞群体外培养注射到小鼠腹腔单克隆抗体种类？分泌抗体都能和刺激机体的抗原结合吗？本过程利用了哪些技术、原理？第1次筛选HAT培养基培养液提取腹水提取动物细胞培养技术动物细胞融合技术免疫学技术抗原刺激如何获取？从何处获取脾脏如何筛选出杂种细胞？多种杂种细胞如何筛选出某一杂种细胞？第2次筛选为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合?骨髓瘤细胞是癌细胞吗？两次筛选的作用是？诱导其融合方法克隆、专一抗体检测阳性都能产生和抗原特异性结合的抗体吗？

单克隆抗体制备过程1.科学家用小鼠骨髓瘤细胞与某种细胞融合，得到杂交细胞，经培养可产生大量的单克隆抗体，与骨髓瘤细胞融合的是

A.经过免疫的B淋巴细胞B.没经过免疫的T淋巴细胞

C.经过免疫的T淋巴细胞D.没经过免疫的Ｂ淋巴细胞A2.用动物细胞工程技术获取单克隆抗体，下列实验步骤中错误的是

A．将抗原注入小鼠体内，获得能产生抗体的B淋巴细胞

B．用纤维素酶处理B淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞

C．用聚乙二醇作诱导剂，促使能产生抗体的B淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合

D．筛选杂交瘤细胞，并从中选出能产生所需抗体的细胞群，培养后提取单克隆抗体B4.单克隆抗体制备过程中，骨髓瘤细胞和B淋巴细胞诱导融合后，要用特定培养基筛选出杂交瘤细胞，在这种培养基上不能存活增殖的细胞是（）

①淋巴细胞②小鼠骨髓瘤细胞③B淋巴细胞自身融合细胞④小鼠骨髓瘤细胞自身融合细胞⑤杂交瘤细胞

A．②④B．①③⑤

C．①②③④D．②③C35．下图是单克隆抗体制备流程阶段示意图。(1)

技术是单克隆抗体技术的基础。(2)根据培养基的用途分类，图中培养基属于

培养基。(3)单克隆抗体与常规的血清抗体相比。最大的优越性是

。(4)动物细胞融合除了采用植物细胞原生质体融合常用诱导剂外，还可以采用

。(5)选出的杂交瘤细胞既具备骨髓瘤细胞的

特点，又具备淋巴细胞的

特点。(6)淋巴细胞是由动物体

中的

细胞分化、发育而来。(7)杂交瘤细胞从培养基中吸收葡萄糖、氨基酸的主要方式是

。动物细胞培养选择特异性强，灵敏度高灭活的病毒在体外大量增殖分泌特异性抗体骨髓造血干主动运输2、单克隆抗体的应用单克隆抗体的优点与常规抗体相比，单克隆抗体产量高，特异性强，灵敏度高，优越性十分明显。应用主要有：3、作为载体，运载抗癌药物，形成“生物导弹”治疗肿瘤资料：目前世界各国已经研制出数以百计的单克隆抗体。许多缺乏良好诊断手段的传染病、免疫性疾病、血液病、内分泌疾病和遗传病，用单克隆抗体作为诊断手段，是一个必然趋势。另外，用单克隆抗体做体内诊断，借以鉴别和定位体内“病灶”也引起人们的注意，目前，主要用于肿瘤追踪及心肌梗塞的诊断。2、在疾病诊断、治疗和预防方面，具有特异性高、灵敏度高等优越性。1、在基础理论研究中具有重要意义3.关于单克隆抗体，下列叙述不正确的是

A．可以制成诊断盒用于疾病的珍断

B．可以与药物结合，用于病变细胞的定向治疗

C．可以利用基因工程技术生产

D．可以在生物体内生产，不能在体外生产D下图表示用生物工程制备人抗A抗体的过程。请回答下列问题（1）人的红细胞膜表面有被称为凝集原的特异______：从免疫学角度看，这种凝集原是________。（2）图中细胞中1是小鼠体内注入人A型血红细胞后而获得的

细胞，这种细胞具有产生________________的特点，但难以在体外培养。甲培养皿中培养的细胞2，是从患骨髓瘤的小鼠体内获取的骨髓瘤细胞，这种细胞在体外培养时能________________，但不会产生抗体。（3）为了能充分发挥上述两种细胞各自的特点，经特殊处理，在促细胞融合因子的作用下，使两种细胞发生融合，形成图中的细胞3，这种细胞称为________________。把它在乙培养皿中进行培养，则能产生大量的细胞群，这种方法称为_____________。（4）过程①的主要目______________。通过过程②或③的培养方法能产生大量__________________抗体。单克隆杂交瘤细胞快速大量增殖单一的抗A抗体免疫B淋巴抗原糖蛋白筛选出能产生单一抗A抗体的杂交瘤细胞

单克隆抗A单克隆上图是单克隆抗体制备过程示意图。据图回答：（1）通过①过程得到的B淋巴细胞从小鼠体内分离出之前，应对小鼠进行的处理是_______________，该处理的实质是在小鼠体内发生________________________反应。（2）骨髓瘤细胞与进行原代培养的细胞相比较，核内的结构发生的主要变化是

，从而违背了“程序性细胞死亡”规则，打破了细胞产生与死亡的动态平衡。（3）培养瓶中的杂交瘤细胞在有丝分裂中期，核内DNA分子数：染色体数＝

。（4）试设想运用生物工程其它领域的技术制备单克隆抗体的一条途径：_________________

。注射相应抗原体液免疫遗传物质（原癌基因）发生了改变2：1运用基因工程方法制造含有某种抗体的基因的工程菌进行发酵生产总结一种诱导细胞融合的新方法一种新细胞灭活病毒杂交瘤细胞一个优势单克隆抗体特异性强、灵敏度高的优势6、植物体细胞杂交与动物细胞融合比较细胞壁再生细胞工程植物体细胞杂交动物细胞融合实质内容理论基础诱导手段诱导过程应用

改变遗传物质、产生新性状，获得细胞产品（使后代具有双亲的特性）植物细胞全能性、生物膜的流动性细胞增殖、生物膜的流动性物理：离心、振动、电刺激化学：聚乙二醇物理：离心、振动、电刺激化学：聚乙二醇生物：灭活病毒（如仙台病毒）去细胞壁（纤维素酶、果胶酶）原生质体融合（杂种原生质体）植物细胞培养（获得杂种植株）获得分离单个动物细胞（胰蛋白酶）诱导融合（杂种原生质体）动物细胞培养（细胞产品）白菜—甘蓝等杂种植物单克隆抗体的制备（杂交瘤细胞）超链接细胞间物质主要是蛋白质。胃蛋白酶作用适宜pH约为2，pH大于6，胃蛋白酶会失去活性。胰蛋白酶作用适宜pH为7.2～8.4。多数动物细胞培养的适宜pH为7.2～7.4，进行动物细胞传代培养时用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要是什么成分？用胃蛋白酶行吗？为什么动物细胞培养要添加血清?血清中含有蛋白质,氨基酸,葡萄糖,激素等,蛋白质是白蛋白和球蛋白.氨基酸有多种,是蛋白质合成的基本成分,激素：胰岛素,生长激素等及多种生长因子,多种未知的促细胞生长因子,促贴附因子及其它活性物质,

一般要添加剂10%～20%的血清HAT选择性培养液普通动物细胞培养液中加入次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷酸(T)DNA合成有两条途径生物合成途径（“D途径”）应急途径或补救途径（“S途径”）氨基酸及其他小分子化合物核苷酸核酸叶酸作为辅酶催化此反应氨基喋呤（A）是叶酸的拮抗物次黄嘌呤(H)和胸腺嘧啶核苷(T)次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶（HGPRT）胸腺嘧啶核苷激酶（TK）核苷酸核酸效应B细胞：骨髓瘤细胞：D途径正常、S途径正常D途径正常、S途径异常效应B细胞效应B细胞－效应B细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞－骨髓瘤细胞效应B细胞－骨髓瘤细胞有D途径、被阻断有S途径但无增殖能力有D途径、被阻断无S途径有D途径、被阻断有S途径有增殖能力√单克隆抗体制备过程中，总共有两次筛选，第一次筛选出杂交瘤细胞，第二次筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞，两次筛选的原理和方法是不相同的。

第一次筛选的原理与方法：细胞融合后，杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键。普遍采用的HAT选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中加入次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷酸（T）。其依据是细胞中的DNA合成有两条途径：一条途径是生物合