壳聚糖抗菌活性影响因素

第176Vol.17No.2000年12CHINESEJOURNALOFAPPLIEDCHEMISTDec.壳聚糖抗菌活性的影响因李治管云林* 300072),研究了壳聚糖的浓度、脱乙酰化度、分子量、pH值等因素,.结果表明:在研究范围内,随着浓度和脱乙酰化度的提高,抗菌活性增强;随分子量的增加,抗菌活性出现先增强而后略有减弱的趋势,转折点在9.16×104前后;在pH为6.5左右,抗菌活性最优.通过激光共焦显微镜对异硫酸(FITC)(Mw=8000)与大肠杆菌作用的观察,发现具有抗菌性的壳聚糖齐聚物进入到了细菌细胞的.用扫描电镜观察分子量为27.4×104的壳聚糖对大肠杆菌的作用发现壳聚糖使菌体凹陷变形,并伴有自溶现象.,,大肠杆菌号:O636壳聚糖(Chitosan是由甲素(Chitin脱乙酰基制得的.由于其资源丰富无毒无污染且具有良好的生物相容性和生物可降解性,因此开发应用研究进展很快[1.早在1979年,Allan等[2就提出壳聚糖具有广谱抗菌性.此后有许多学者对壳聚糖的抗菌机理进行了研究[3.根据壳聚糖在细胞上的作用靶位不同,学术界将其抗菌机理推测为两类:是ong等[ 以细菌带有负电荷的细胞膜为作用靶的机理;是Hdger[5以细菌中N为作用靶的抗菌机理.到目前为止,壳聚糖的抗菌机理尚无定论.本文针对壳聚糖在仿生抗纤维中的应用,系统地研究了壳聚糖抗菌活性的影响因素,并采用激光共焦显微镜观察了壳聚糖齐聚物对细菌细胞的作用为今后织物菌及拓宽壳聚糖的应用领域提供理论依据和数据参考.实验756-MC型紫外分光光度计,市光学仪器厂生产;HITACHI-X510型扫描电子显微镜,日立公司生产;TCSNT激光共焦显微镜,Leica公司生产.壳聚糖由青岛药物提供;大肠杆菌菌种由大学生命科学学院提供;生化试剂牛肉膏、蛋白胨、琼脂,市东方卫生材料厂生产;盐酸、醋酸、氢氧化钠、氯化钠均为化学纯.培养基牛肉膏5g蛋白胨10gNaCl5g用去离子水定容至1000mL,用1molLNaOH或HCl调节pH至7.0～7.2,高压蒸气灭菌.用接种环取一环低温贮藏的斜面大肠杆菌(Escherichiacoli)菌种,转接到250mL液体养基中,37150rmin)24h,1mL此菌液,在以上99923收稿,2000057国家自然科学基金资助项目(初始菌液.324h后漂洗,在临界点干燥器内干燥,置于扫描电镜下观察.将壳聚20mLV(水)V(乙醇)=11的混合溶剂中,加入FITC溶液,冰点下搅拌反应24h;将FITC-壳聚糖齐聚物离心沉淀,用乙醇漂洗,晾干.得FITC标记物.将FITC-壳聚糖溶于培养基中,调节pH至7.0左右,加大肠杆菌培养液,在摇振荡24h后,培养到FITC-壳聚糖齐聚物上的大肠杆菌,用离心机收集,生理盐水漂洗;50%(质量分数)甘油水溶液处理后再用).最后用激光共焦显微镜观察荧光现象.以上操作均4将一定量的壳聚糖样品,1%HAc溶液中,1%的壳聚醋酸溶液将培养基分装在试管中10mL/02mL醋酸溶液,37150r/min振荡.定时取样,1%的HAc溶液为空白样作参比,用紫外分光光度计测定细菌培养液的浊度(O.D.),并以此表征壳聚糖的抗菌活性.结果与1显微镜分图表肠描镜.可以看出,含粘面只吸附了少量大肠杆菌细胞,且细胞形态未发生变化;胞.说明壳聚糖对大肠杆菌有较强的吸附能力并可使其细胞变形乃致溶解.Fig. SEMmicrographsofE.colionViscoseRayon(a)andthatwithchitosa图2为与壳聚糖齐聚物作用的大肠杆菌细胞的激光共焦显微镜,图中荧光部分为被FITC标记的壳聚糖齐聚物,荧光所围成的轮廓为大肠杆菌,图2(a)自上而下,由左向右依次为含有壳聚糖齐聚物(Mw=8000)的大肠杆菌细胞由表及里的剖面图,2(b)是其最中间的剖面,由图2(a)和(b)可见,由菌体表面到,荧光逐渐增强,说明壳聚糖齐聚物(Mw=8000)进入到了杆菌细胞.Fig.2TSCLSMmicrographsofE.colionFITCChitosanoligomer(Mw=aseconsnsequenceroousdeonsdeoEcolicell;bcenerseconoEcoli2.2图3为壳聚糖浓度质量分数与大肠杆菌培养液浊度的关系图.,随着壳聚糖浓度的增大,细菌培养液浊度减小,表明壳聚糖抗大肠杆菌的活性随着其浓度的增大而提高.0～1%时,这种趋势尤为明显.Fig.3PlotsofchitosanconcentrationandtheantibacterialactivityofchitosanMw5 04,DA74%,pHgrow eoEcolinhen6h; h;24

Fig.4EffectofdeacetylationdegreeontheantibacterialactivityofchitosanMw8504,(chosan)0%,pHgrowngeoEcolinhenocu24h;▲5h;○6图4为壳聚糖脱乙酰化度与大肠杆菌培养液浊度的关系图.在研究范围内,随着壳聚糖壳聚糖的脱乙酰化过程,是其分子NHCOCH3逐渐被NH2取代的过程.+结合形成NH+正电离子,随着壳聚糖脱乙酰化度的,其分子链上的正电荷—NH也增,对于细菌(带有负电)的静件下,—NH2易与 引力增强 的细菌被絮凝,聚沉,其生长繁殖也随之减弱,即表现为壳聚糖的抗菌性随着其脱乙酰化度的增大而增强3图5为壳聚糖分子量对大肠杆菌培养液浊度的影响关系图.,随着壳聚糖分子长呈现先增强而后略有下降的趋势,其转变区间是Mw=9.1610前后壳聚糖在溶液中呈无规线团状,随着分子时端基减少,使得壳聚糖内有效因子—NH2也略有增多,二者均使其对细菌的吸附和絮凝能力增强;随着分子量的进一步增大,溶液的粘度增加,度的增加使部分因子—N

被包埋在大Fig.5 EffectofchitosanmolecularweightonitsantibacterialactivityDA=74%,pH=,(chitosan)=0.1%growingtimeofE.coliintheinoculum:□4h;▲3 24

6pH值与大肠杆菌培养液浊度关系图.由图中可以看出,pH6.5附近浊度最小壳聚糖显示出最强的抗菌性.壳聚糖是一种弱碱性聚电解质其分子中—NH+3pKa=6.

,高于此pH值时,较差,并且—NH3+上的质子被中和,因子减少,抗菌效果减弱;pH值时,因子的总量不变但溶液中的大量H+与—N+3在细菌表面产生竞争性吸附,同样造成3YoungHadwiger5等的工作,并针对上述两组电镜分析结果,可以初步推测壳聚糖的+1:在酸性条件下,壳聚糖分子中的质子化铵—NH3具有正电性,吸附带有负电荷的细菌,使细菌细胞壁和细胞膜上的负电荷分布不均,干扰细胞壁的,打破了在自然状态下+

Fig.6EffectofpHontheantibacterialactivityofchitosanMw=18.51×104,DA=74%(chitosan)=0.growingtimeofE.coliinthe□6h;●6h;+24的细胞壁与溶解平衡,使细胞壁趋向于溶解,细胞膜因不能承受渗透压而变形破裂,细胞的内容物、蛋白质等渗出,发生细菌溶解而.模型2:壳聚糖齐聚物(Mw=8000)吸附细菌后,穿过大肠杆菌的多孔细胞壁进入到细菌细胞内,可能与DNA形成稳定的复合物,干扰DNA聚合酶或RNA聚合酶的作用,阻碍了DNA或RNA的,从而抑制了细菌的繁殖.参考文1(LINWeiZhong).食品科学(ShipinKexue),1986,12:AllanC,AdnigerLA.ExpMycop,1979:MuzzarelliR,JeuaiauxC,GoodayGWChitininNatureandTechnologyNewYork:1985:YoungDH,KnoleH,KaussE.PlantPhysiology,1982,70:1449;1983,73:MuzzarelliR,JeuaiauxC,GoodayGW.ChitininNatureandTechnology.NewYork:PlenumPress,1985:210MuzzarelliRAA.CarbohydratePolym,1996,81:OntheFactorsInfluencingtheAntibacterialActivityofChitosanDong-Zhi,LIUXiao-Fei,LIZhi,XUHuai-Yu,GUANYun-Lin*,YAOKang-(SchoolofMaterial,TianjinUniversity,TianjinTheeffectsofconcentration,deacetylationdegree,molecularweightandpHofmediumontheantibacterialactivityofchitosanagainstEsherichiaColihavebeeninvestigated.Theresultsshowedthattheantibacterialactivityofchitosanincreasedwithincreaseinconcentrationanddeacetylationdegreeanditincreasedwithincreasingmolecularweight,reachedaumatMw=9.1610andpH=6.5andthendecreasedwithfurtherincreaseinmolecularweight.Theeffectso