分子生物学实验课-实验二

实验报告实验结束后，应及时整理和总结实验结果及记录，按照下列顺序写出实验报告：实验报告首页：实验名称（The

titleof

experiment

）；

；学号；班级；组别；同组同学；带教教师；实验日期等。正文：①原理（Principle）；②操作步骤（Operational

procedure）；③实验结果（Results）：包括

、原始数据、计算过程及图表等；④

（Discussion）：对实验方法，实验结果和异常现象进行探讨和评论，以及对于实验设计的认识、体会和建议。成绩评分标准50%实验+50%理论考试平时成绩：实验纪律

早退，着装规范，实验服实验操作规范，卫生值日每次实验后整理卫实验报告7设计性实验8次实验总分最后按比例计入总成绩。实验报告存档，不归还。理论考试内容来自于讲义及平时教学。第八次设计性实验课安排分组方案：4人一组（无法组队同学加入其它组）答辩ppt内容：实验目的，意义，原理，实验方法选择，预计结果及数据表现形式，实验难点及可能出现问题，可能出现的实验结果偏差及解释答辩安排：最后一周答辩，每组时间控制为20分钟

，10分钟提问。设计性实验题免疫球蛋白IgG的分离纯化与鉴定。人

白蛋白的提取纯化及分子量的测定。蛋清中溶菌酶的分离鉴定。小鼠肝脏过氧化氢酶的分离纯化及酶动力学研究。如何从动物心肌细胞中提取乳酸脱氢酶同工酶？如何提取真核细胞中的线粒体 组DNA？请设计实验从

及蛋白表达角度

老年痴呆症模型小鼠与人类老年痴呆症的可比较性（即小鼠模型建立的可靠性）8

请设计实验从

及蛋白表达角度追踪老年痴呆模型小鼠发病期典型变化，及给药治疗后效果评价9蛋白质的表达具有一定的组织特异性，请以实验小鼠胰腺和肝脏为材料设计实验检测羧肽酶A1酶原(procarboxypeptidaseA1)和白蛋白(Albumin)并计算这两种蛋白质在胰腺和肝脏中的表达量。动物细白质的提取和含量测定蛋白质是生命现象的物质基础之一，是生物体最重要的组成部分。因此，对蛋白质的结构与功能研究，是生命科学的

问题。要研究蛋白质的结构与功能，往往从细胞中提取蛋白质开始，而对蛋白质含量的测定则是蛋白质相关研究中的必备技术。基本原理动物肝脏细胞比较脆弱，易于破碎，故本实验选用小鼠肝脏细胞作为实验材料。采用匀浆法将其破碎，然后加入样品提取液使蛋白质溶解，用高速离心法弃去细胞碎片。收集上清液后可进行蛋白质定量分析。蛋白质提取中最常见的问题是目的蛋白质发生变性和被蛋白酶降解。基本的防范措施是尽可能缩短提取时间和在尽可能低的温度下进行提取。为了防止蛋白酶的破坏，可在提取液中加入蛋白酶抑制剂。苯甲磺酰氟（PMSF）可以抑制丝氨酸蛋白酶和某些半胱氨酸蛋白酶；胃蛋白酶抑制剂，可抑制酸性蛋白酶；乙二胺四乙酸（EDTA）可抑制金属蛋白酶。为了防止蛋白质的巯基发生氧化，可加入一定量的还原剂如巯基乙醇、二硫苏糖醇。溶液中如果存在重金属离子（如铝、铜、铁离子）可能会与蛋白质形成不溶复合物，可在溶液中加入一定浓度的EDTA。目前蛋白质的含量测定常用的方法有定氮法、双缩尿法（Biuret法）、Folin－酚试剂法（Lowry法）、考马斯亮蓝法（Bradford法）、BCA法和紫外吸收法。其中考马斯亮蓝法（Bradford法）和Lowry法灵敏度较高，比紫外吸收法灵敏10～20倍，比Biuret法灵敏100倍。上述这些方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这几种方法测定，有可能得出几种不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。在选择方法时应考虑：①实验对测定所要求的灵敏度和精确度；②蛋白质的性质；③溶液中存在的干扰物质；④测定所要花费的时间。Lowry法：该法的原理主要是根据蛋白质中的肽键在碱性溶液中能与铜离子结合形成复杂的络合物（类似双缩脲反应）。由于蛋白质中酪氨酸的存在，该络合物在碱性条件下进而与Folin－酚试剂形成蓝色复合物。Folin－酚试剂仅在酸性条件下稳定，蛋白质在碱性下显色，在加入试剂后要充分混匀，在Folin－酚试剂被破坏前发生显色反应。上述呈色反应色泽深浅与蛋白质含量成正比。因此通过比色，参照已知含量的标准蛋白质的比色标准曲线，可确定待测样品的蛋白质含量。适合测定1--300ug/ml浓度范围蛋白质考马斯亮兰法：考马斯亮兰G-250

，在酸性溶液中与蛋白质结合，

的最大吸收峰的位置为595nm，溶液的颜色由棕黑色变为兰色。主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。在一定范围内，考马斯亮兰G250-蛋白质复合物在595nm下，吸光度与蛋白质含量呈线性关系。故可以用于蛋白质含量的测定。适合测定10--100ug/ml浓度范围蛋白质紫外吸收法测定蛋白质浓度：蛋白质中普遍含有酪氨酸与色氨酸，由于这两种芳香族氨基酸分子中含有大π键，它们在280

nm紫外光附近有光吸收。因而使蛋白质在上述紫外波长附近产生较强的光吸收，利用蛋白质的这一特性可对其进行含量测定。适合测定20--100ug/ml浓度范围蛋白质操作步骤用颈椎脱臼法处死小鼠，切开腹腔，取下完整肝脏，去掉胆囊（不要弄破），放入盛冷生理盐水的烧杯中漂洗干净。取小鼠肝组织0.5g，在滤纸上剪碎，放入玻璃匀浆管中。按1：15的比例往玻璃匀浆管中加入7.5ml匀浆缓冲液，手动匀浆。注意用力均匀，以免损坏匀浆管。匀浆完成后，取一只2mL

eppendorf管，加入1.8mL匀浆液后，置入冷冻离心机中。取出上清5．于4℃，13000

rpm离心20分钟后，液至2

mL

eppendorf管中.上清液一部分冰浴保存，作为待测样品备用。0.5ml冷冻保存。Lowry法1．取16

mm*150

mm试管16支，标明号码，放置在试管架，在1～6号试管内分别加入标准牛

白蛋白（使用时取贮液蒸水稀释至0.5

mg/mL）0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5

mL，蒸水补足至每管总体积0.5

mL。在7、8号试管内分别加入待测样品25、50μL，并

蒸水补足至0.5mL（即将待测样品稀释20或10倍）。9～16号重复1～8号。各管加入2.5mL新配制的碱性铜溶液，立即摇匀，在室温下放置10min。各管加入0.5

mL

Folin酚试剂应用液，边加入边立即充分混合（用震荡混合器），然后在室温下放置30～60min（不要超过60min）。将标准样品及待测样品在可见光光度计上在550

nm波长下比色。根据已知含量的标准样品测得的吸光度做标准曲线，然后根据待测样品的吸光度在标准曲线上查出其蛋白质含量。根据稀释倍数计算出小鼠肝脏提取液的蛋白质含量。考马斯亮兰法测定蛋白质浓度1．取16

mm*150

mm试管16支，标明号码，放置在试管架，在1～6号试管内分别加入标准牛白蛋白（使用时取贮液蒸水稀释至0.5

mg/mL）0、0.02、0.04、0.06、蒸水补足至每管总体积0.08、0.1

mL，0.1

mL。在7、8号试管内分别加入稀释20、10倍的待测样品0.1

mL。9～16号重复1～8号。每管加入考马斯亮兰G250

试剂3

mL,摇匀，室温静置3分钟。分光光度计

长595nm比色。根据已知含量的标准样品测得的吸光度做标准曲线，然后根据待测样品的吸光度在标准曲线上查出其蛋白质含量。根据稀释倍数计算出小鼠肝脏提取液的蛋白质含量。紫外吸收法测定蛋白质浓度1．取16

mm*150

mm试管16支，标明号码，放置在试管架，在1～6号试管内分别加入标准牛

白蛋白（2

mg/mL）0、0.3、蒸水补足0.45、0.6、0.7

5、0.9

mL，至每管总体积3