《基因操作原理》课程教学大纲

《基因操作原理》课程教学大纲课程编码：3043009402课程名称：基因操作原理总学分：3总学时：48课程英文名称：PrinciplesofGeneManipulation先修课程：生物学，生物化学，遗传学，分子生物学等适用专业：生物技术,生物科学,应用生物技术,生物工程等一、课程教学目的《基因操作原理》是伴随着生物学尤其是分子生物学的飞速发展而兴起的一门新学科。是分子生物学系列教材中的重要环节，是一门直接利用分子生物学基础知识指导分子生物学实验操作的理论与实践相结合的课程,其上承接《分子生物学》课程，其下有《分子克隆技术》作为本课程配套的实验课程。本教材以基因工程的操作技术，即基因操作原理为主线，重点介绍在核酸水平上进行各种操作的基本原理和技术步骤，希望通过对基础原理的认识，能够理解和掌握实践中具体操作的原理和步骤，并能自主选择或设计相关的实验方法；掌握通过基因工程的方法实现物种改种和生物制药的途径和工作原理。二、课程教学任务任务重点介绍基因操作中的工具酶及其种类、活性和用途；质粒载体、噬菌体载体和表达载体等的基本构成、种类和用途；重组DNA导入细菌和真核细胞的方法；DNA、RNA和蛋白质的分离及检测技术；定点诱变技术；PCR技术原理及其应用；cDNA文库和基因组文库的构建；分子杂交原理和技术；DNA序列分析的原理，通过Internet进行序列分析处理以及数据的获取。本门课程开设的指导思想在于使学生在掌握一般生物学以及分子生物学知识的基础上，掌握DNA重组，转移、表达和检测等技术的基本概念和基本原理，为日后从事基因工程和分子生物学研究打下技术操作方面的理论基础。三、课程教学内容的结构课程组将分子克隆的具体技术与基因研究的宏观策略按照“宏观-微观”、“微观-宏观”的方式，实现动态知识与静态基础的有机统一，主要分为四个层次：基因操作静态知识。讲授进行基因操作必备的常用工具，包括分子克隆工具酶（14学时），分子克隆载体（24学时）；基因操作动态知识。讲授进行基因操作的常用技术，包括生物大分子的分离、分析与检测技术，PCR技术，基因的表达，基因的诱变，基因的序列测定等（18学时）；基因克隆的原理和策略。讲授基因文库的构建，文库筛选的策略（4学时）；融会贯通。通过学生互动和专题课程讲座等形式（2学时），将基因操作的基础知识和研究策略融会贯通。四、模块或单元教学目标与任务安排绪论：基因操作的理论基础 （2学时）教学目标：理解基因的概念，基因的结构组成和各种关键元件，掌握基因克隆的基本策略。重点与难点:掌握与基因操作有关的基本概念。1.1基因的概念（0.5）1.1.1什么是基因1.1.2基因与其产物的共线性及非共线性1.1.3基因的重叠与可变性1.2基因的结构组成（1）1.2.1启动子1.2.2SD序列1.2.3转录终止区1.2.4其它1.3基因克隆的通用策略（0.5）1.3.1基本步骤1.3.2亚克隆基因操作工具酶（8.5学时）教学目标：深入了解各种分子生物学常用工具酶的种类、特点和工作原理，通过实例分析，掌握各种常用工具酶的用途。重点与难点:要求掌握和了解限制酶与常用工具酶的种类\活性和用途,让学生知道“基因操作原理”是靠什么“工具”来完成的。2.1限制酶（3）2.1.1限制酶的发现及其命名2.1.2限制酶识别的序列2.1.3限制酶产生的末端2.1.4末端长度对切割的影响2.1.5位点偏爱1.1.6酶切反应条件2.1.7星星活性2.1.8单链DNA的切割2.1.9酶切位点的引入(酶切水平)2.1.10影响活性的因素2.1.11酶切位点在基因组中分布不均一性2.2甲基化酶（1）2.2.1甲基化酶的种类2.2.2依赖于甲基化的限制系统2.2.3甲基化对限制酶的酶切影响2.3DNA聚合酶（2.5）2.3.1大肠杆菌DNA聚合酶2.3.2Klenow酶2.3.3T4噬菌体DNA聚合酶2.3.4T7噬菌体DNA聚合酶2.3.5耐热DNA聚合酶(第7章中详细介绍)2.3.6反转录酶2.3.7末端转移酶2.4其它工具酶（2）2.4.1RNA2.4.2连接酶2.4.3T4多核苷酸酶2.4.4碱性磷酸酶2.4.5核酸酶2.4.6RNA酶抑制剂2.4.7琼脂糖酶2.4.8DNA单链结合蛋白2.4.9其它分子克隆载体（13.5学时）教学目标：深入了解各种载体的特征和工作原理，掌握各类载体的用途。重点与难点:重点掌握质粒、λ噬菌体、粘粒和M13噬菌体的组成结构和用作基因克隆的工作原理，了解其它克隆载体，表达载体和其它功能性载体的种类及其工作的基本原理。3.1.质粒载体（2.5）3.1.1质粒的基本特性3.1.2标记基因3.1.3质粒载体的种类3.2λ噬菌体载体（4）3.2.1λ噬菌体的分子生物学3.2.2λ噬菌体载体的选择标记3.2.3代表性λ噬菌体载体3.3粘粒载体（1.5）3.3.1粘粒的结构特征3.3.2用作基因克隆的原理性步骤3.3.3用途3.3.4粘粒克隆载体3.4单链丝状噬菌体载体（1.5）3.4.1M13噬菌体的生物学3.4.2M13噬菌体载体3.4.3噬菌粒3.4.4M13KO73.5高通量克隆载体（1）3.5.1酵母生物学简介3.5.2酵母人工染色体3.5.3细菌人工染色体3.5.4PAC载体3.6大肠杆菌表达载体（2）2.6.1表达融合蛋白的表达载体2.6.2非融合蛋白表达载体3.7其它功能性载体（1）2.7.1穿梭载体2.7.2启动子克隆载体2.7.3复制子克隆载体2.7.4整合载体2.7.5解离载体基因操作中的分离与分析技术（9.5学时）教学目标：理解基因操作中DNA和RNA的分离纯化和分析原理，掌握DNA和RNA的各种分离与分析技术。重点与难点:重点掌握大肠杆菌质粒DNA分离纯化,琼脂糖凝胶电泳和DNA片段回收的方法性原理以及RNA分离纯化的注意事项和分离及电泳方法。要求掌握印迹分析的种类、原理和方法，特别要求掌握这些方法的运用对象，达到能灵活运用这些方法的目的。4.1DNA的分离检测和纯化（3）4.1.1E.coli质粒DNA的分离纯化4.1.2DNA的电泳检测4.1.3DNA的纯化4.2RNA的分离纯化和检测（1）4.3分子杂交（3）4.3.1Southern杂交4.3.2Northern杂交4.3.3Western“杂交”4.4RNA端点分子（0.5）4.4.1S1酶作图4.4.2.Primerextension4.5基因芯片（0.5）4.5.1基因芯片的分类4.5.2基因芯片技术的理论基础4.5.3DNA芯片的应用4.6RNAi（0.5）4.7DNADNA与蛋白质相互作用检测技术（1）4.7.1凝胶阻滞实验4.7.2DNaseIfootprintingPCR技术及应用（5.5学时）教学目标：在进一步了解PCR技术的基本原理的同时，深入理解PCR的操作程序和引物设计原理，掌握PCR技术在科学研究中的各种应用。重点与难点:要求重点掌握PCR技术的基本原理、基本操作程序以及引物设计方法，了解利用PCR技术原理所衍生出来的技术方法的种类和工作原理，达到能够自觉合理地利用PCR技术为研究和应用服务。5.1PCR的基本原理（2）5.1.1PCR运行的基本原理5.1.2PCR反应体系5.1.3PCR反应程序5.2PCR技术的应用（3.5）5.2.1PCR介导的克隆5.2.2PCR介导的诱变5.2.3PCR鉴定和诊断5.2.4实时定量PCR5.2.5其它PCR方式DNA序列分析 （2学时）教学目标：深入了解DNA测序的基本原理，掌握序列分析的基本方法和策略。同时了解DNA测序技术的发展现状和最新的DNA测序技术。6.1Maxam-Gilbert化学降解法（0.5）6.1.16.1.26.2Sanger双脱氧终止法（0.5）6.2.16.2.26.2.3PCR6.3高通量测序技术1DNA文库的构建（2学时）教学目标：理解基因文库构建的基本原理和类型，掌握基因文库构建的步骤与方法。重点与难点：要求结合前面所学的内容，重点掌握基因文库构建的基本原理和步骤，并由此掌握基因文库构建的方法和类型，可自行设计和选择构建基因文库的步骤和方法。7.1基因组文库的构建（0.5）7.1.1载体的选择7.1.2用lphage构建文库7.1.3重组体的筛选和分析7.1.4亚基因组文库的构建7.2cDNA文库的构建（1）7.2.1cDNA克隆的mRNA制备7.2.2cDNA第一链的合成7.2.3cDNA第二链的合成7.2.4双链cDNA的分子克隆7.2.5cDNA克隆用的载体7.3利用文库进行基因克隆的策略（0.5）7.3.17.3.2DNA定点诱变 （2学时）教学目标：理解各种DNA定点诱变方法的原理，掌握利用寡核苷酸进行定点诱变的方法。重点与难点:要求学生掌握对DNA进行定点诱变所使用的方法和种类及其用途,重点掌握利用寡核苷酸进行定点诱变的方法和原理。8.1寡核苷酸介导的诱变（1）8.1.1Kunkel法8.1.2位点选择定点诱变法8.2PCR介导的分子诱变（1）8.2.18.2.28.2.3第9章重组DNA导入宿主细胞的方式（1学时）教学目标：了解对不同宿主细胞转化的方式，理解大肠杆菌的转化原理，掌握大肠杆菌和芽胞杆菌的转化方法。重点与难点:掌握大肠杆菌的转化方法以及电转化的原理及应用对象,了解DNA导入宿主细胞的方式。9.1.大肠杆菌的转化9.1.1常规转化方法(CaCl2法9.1.29.1.39.2芽胞杆菌的转化9.2.1原生质体融合9.2.29.2.39.2.4