氨甲喋呤联合咖啡因对骨肉瘤细胞株的作用观察

氨甲喋呤结合咖啡因对骨肉瘤细胞株的作用观察【摘要】［目的］观察氨甲喋呤结合咖啡因对骨肉瘤细胞株的作用。［方法］以国人骨肉瘤细胞株S-732细胞为研究对象，根据析因试验设计原因，设1无药组〔阴性对照组〕，2咖啡因组，3氨甲喋呤组，4咖啡因、氨甲喋呤结合用药组〔混合用药组〕。培养一段时间后，分别采用TT法细胞毒性试验和流式细胞仪〔F〕分析，观察3组药物对细胞的毒性〔用残存细胞吸光度A值表示〕及细胞周期的影响。［结果］F分析各组于48hG2/期细胞比例〔%〕为1组〔23.210±0.416〕，2组为〔23.120±0.440〕，3组为〔28.770±0.531〕，4组〔23.267±0.319〕，1组与2组间差异无统计学意义，其余各组间差异有统计学意义〔P＜0.01〕。各组残存细胞吸光度A值为1组〔0.411±0.006〕，2组〔0.401±0.006〕；3组〔0.304±0.007〕，4组〔0.105±0.002〕，组间差异及交互作用有统计学意义〔P＜0.01)。［结论］氨甲喋呤与咖啡因具有协同作用，可增加氨甲喋呤对骨肉瘤细胞株的抑制率。【关键词】骨肉瘤；氨甲喋呤；咖啡因；肿瘤细胞,培养的Abstrat［bjetive］TbservehetherrntaffEineaniprvetheyt-txiityeffetfethtrexate(TX)nstesaraellline.［ethd］stesaraell(S-732)ereinubatedithndrug,affEIne,TXrTXaddingaffeineseparately,anderenaedasntrlgrup,affeinegrup,TXgrupandixinggruprespetively.TheratisfellsnG2phasefeahgrupereeasuredithflytetryafter48hinubatinandtheellinhibitinratisereeasurediththeTTlrietrianalysisafter72hinubatin.［Result］Theratis(%)fellsnG2phaseerentrlgrup〔23.210±0.416),affeinegrup〔23.120±0.440),TXgrup〔28.770±0.531〕andixinggrup〔0.105±0.002〕(P＜0.01,exeptntrlgrupbeteenaffeinegrup),theabsrbenyfsurvivalell(Avalue)erentrlgrup〔0.411±0.006),affeinegrup〔0.401±0.006〕；TXgrup〔0.304±0.007〕andixinggrup〔0.105±0.002〕(P＜0.01).［nlusin］affeineaniprvetheyt-txiityeffetfTXnstesaraellline.Keyrds：stesara;TX;affeine;turell,inubatin肿瘤细胞在化疗药物作用后,有的会出现细胞周期受阻的现象，包括G1停滞，S期蓄积，G2期阻滞等。G2期阻滞被认为是细胞的一种保护性调节，可以使DNA受损的细胞获得充分的修复时间，从而顺利地进入下一个细胞周期，防止被诱导凋亡。咖啡因是近年来发现的肿瘤化疗增加剂，主要作用机理是缩短G2期阻滞。氨甲喋呤作用于骨肉瘤细胞后会不会出现G2期阻滞，参加咖啡因能否增加其细胞毒性，目前尚缺乏试验根据。1材料与方法1.1材料S-732细胞株购于北京积水潭医院创伤骨科研究所，RPI1640干粉及胰酶购于美国ib公司，氨甲喋呤购于浙江万马药业，咖啡因购于美国Siga公司，F美国ulter公司消费，酶联免疫检测仪美国da公司消费，2孵箱Sheldnanufaturing公司消费，倒置显微镜重庆光学仪器厂消费，96孔培养板NunlnInternatinal公司消费。1.2方法1.2.1细胞培养细胞常规培养于体积分数为10%新生小牛血清〔经56℃30in水浴灭活〕的RPI1640培养液中，其中含有青霉素100IU/l及链霉素100μg/l，在37℃体积分数为5%2、95%空气、饱和湿度的2孵箱内闭式培养。取传代后第3d处于指数增殖期的细胞备用。1.2.2细胞处理取生长良好的细胞，以少量胰蛋白酶将贴壁细胞消化、离心，倒去上清液，参加适量RPI1640培养液，用吸管反复吹打均匀制成细胞悬液。根据析因试验设计原理将细胞株分为4组，1组无药组〔阴性对照组〕；2组咖啡因组，培养液内参加咖啡因，浓度为5.0l/L；3组氨甲喋呤组，培养液内参加氨甲喋呤，浓度为320μg/l；4组混合用药组，培养液内同时参加浓度为5.0l/L的咖啡因与浓度为320μg/l的氨甲喋呤。同时调整细胞浓度为2×105/l。各组细胞参加96孔培养板，每组设3复孔，每孔200μl。置37℃体积分数为5%2、95%空气、饱和湿度的2孵箱内闭式培养，供测量各组药物的细胞抑剂率。同时各组取一样浓度的细胞悬液10l于培养瓶中在37℃体积分数为5%2、95%空气、饱和湿度的2孵箱内闭式培养供观察G2期比例。1.2.3流式细胞仪〔F〕对细胞周期进展分析将置于培养瓶内的各组细胞于48h取出，以0.25%胰蛋白酶消化3～5in，至贴壁细胞间出现筛状间隙为止。弃去消化液，加Hank’s液。用吸管将细胞自瓶壁上轻轻吹打下来，并移入离心管中。短时低速离心〔1000r/in，5in)。弃上清，加冷PBS〔pH7.4)，均匀吹打，并短时低速离心3次〔1000r/in,5in)以去除悬液中的细胞碎片。再次参加冷PBS〔pH7.4)均匀吹打，制成单细胞悬液。将细胞液以500目尼龙网过滤，以去除重叠成团的细胞。调整细胞浓度为1×104/l。在4℃冰箱内进展荧光染色后用流式细胞检测G2期细胞百分比。每组细胞测3次，用SPSS12.0统计软件，对结果进展方差分析。1.2.4TT法测定各组细胞的A值及抑制率72h后将96孔板取出，每孔再加1∶2稀释的TT应用液〔5g/l)20μl,继续培养4h后弃除上清液，于每孔中参加10%的二甲亚砜10μl，振荡5in，直到结晶完全溶解，液体呈蓝紫色，然后在酶联免疫检测仪上以570n波长测定吸光度〔A〕值。并可根据A值计算出各组的细胞抑制率。用SPSS12.0统计软件，对结果进展方差分析，观察各组间的差异及药物间交互作用是否具有统计学意义。转贴于论文联盟.ll.2结果2.1F分析各组48hG2期细胞所占比例〔表1〕1组与2组间差异无统计学意义，其余各组间差异有统计学意义〔P＜0.01〕。单独应用5.0l/L的咖啡因对G2期无明显影响，单独应用氨甲喋呤时出现G2细胞比例增高，二者结合应用后G2期细胞比例降低。表1各组48hG2期细胞所占比例〔略〕2.2TT法测定各组细胞72hA值〔表2〕各组间差异具有统计学意义〔P＜0.01〕。单独应用5.0l/L的咖啡因对骨肉瘤细胞有细微影响，320μg/l的氨甲喋呤对骨肉瘤细胞有较大抑制作用，二者结合应用后可明显减少A值，对肿瘤细胞抑制作用最明显。根据统计分析二者结合具有交互作用，差异有统计学意义〔P＜0.01〕。表2TT法测定各组细胞的A值〔略〕3讨论新辅助化疗的开展及新的细胞毒性药物的使用使包括骨肉瘤在内的许多肿瘤治疗有了明显改观〔1〕，尽管如此，肿瘤细胞对多种化疗药物产生耐药性仍是造成化疗失败的主要原因。传统上对肿瘤耐药及逆转剂的研究主要集中在细胞膜/核膜蛋白，即药物输出泵：如P糖蛋白〔Pgp〕、多药耐药相关蛋白〔RP〕和肺耐药相关蛋白〔LRP〕。已有的逆转剂大局部是针对细胞P糖蛋白〔Pgp)，通过抑制P糖蛋白〔Pgp)对进入细胞内化疗药物的外排作用，进步细胞内化疗药物的程度，来增加化疗药物的杀伤作用。如钙离子通道阻滞剂，环孢酶素A及其衍生物，抗激素类化合物等，但其效果仍欠理想。近年来研究说明，DNA作为多种抗癌药物攻击的靶分子，其损伤修复才能异常与肿瘤耐药性的形成有着亲密关系。因此，从DNA损伤修复的研究入手，将为肿瘤治疗和耐药性逆转开拓新的途径。周期运转中的细胞有一种识别DNA损伤的才能，一旦出现DNA损伤，细胞周期就会受阻，包括G1停滞、S期蓄积和G2期阻滞，从而给细胞修复提供足够的时间。细胞周期素(ylin)为重要的细胞周期蛋白的调控基因。目前发现的ylin有ylinA～H。ylinB主要出如今G2期〔2〕。其表达的产物细胞周期蛋白与P34d2蛋白复合物被称为有丝分裂促进因子(aturatinprtingfatr,PF)。在正常细胞，G2后期PF氨基酸被磷酸化或去磷酸化，从而具有激酶活性，进而诱导一系列底物(如核层蛋白，H1组蛋白，核仁蛋白等)磷酸化，引导核膜崩解，染色质凝聚等有丝分裂所具有的变化。细胞通过抑制ylinB表达，或抑制P34d2激酶活性，使细胞不能进展有丝分裂，从而产生G2期阻滞。YaSL〔3〕等发现，咖啡因有活化受抑制的PF的才能。因此可以缩短甚至取消G2期阻滞，从而可以逆转肿瘤耐药。该原理在国外已经临床使用，并获得不错的临床效果〔4〕。国内也开场对此进展研究。万双林〔5〕等发现平安浓度的咖啡因在骨肉瘤细胞株(S-732)顺铂热化疗中具有增效作用，并发现咖啡因能促进经顺铂热化疗后的骨肉瘤细胞由G2/期向G0/G1期移行，导致G2/期缩短，细胞不能进展足够的DNA修复而进入分裂期，从而加速细胞死亡。李钧等〔6〕的研究说明，咖啡因有促进顺铂诱导骨肉瘤细胞凋亡的作用。目前在临床上使用更多的RsenT12〔5〕化疗方案，其中氨甲喋呤作用于骨肉瘤细胞后，是否出现G2期阻滞，咖啡因能否缩短甚至取消G2期阻滞，二者结合应用能否增加肿瘤细胞抑制率，尚未见报道。作者根据析因试验设计原因，设置4个实验组，用F测定各组细胞于48hG2期比例，用TT法来测定各组药物对肿瘤细胞作用72h后残存细胞吸光度，结果显示，单纯应用5.0l/L咖啡因，对肿瘤细胞G2期比例无明显影响，对肿瘤细胞有细微抑制；单纯应用氨甲喋呤，增加G2期比例，对肿瘤细胞有抑制作用；二者合用后G2期比例有明显降低，对细胞抑制明显。根据统计分析，二者间交互作用具有统计意义〔P＜0.01〕。本实验提示，氨甲喋呤与咖啡因结合，可以进步对骨肉瘤细胞株的抑制作用。但由于体外细胞培养不能模拟体内的三维构造，不能准确地反映药物在人体中的全面作用，因此，本试验结果需要更进一步的验证。【参考文献】〔1〕郭全义，卢世璧，张莉，等.骨肉瘤的治疗及生存率的多因素分析［J］.中国矫形外科杂志，2022，14：497-499.〔2〕SandbergAveryA,BridgeJuliaA.Updatesntheytgenetisandleulargenetisfbneandsfttissuetursstesaraandrelatedturs［J］.anerGenetytgenet,2022,145:50-55.〔3〕YaSL,AkharAJ,kennaKA,etal.Seletiveradisensitivizatinfp53defiientellsbyaffEine-ediatedativatinfp34d2kinase［J］.Nated,1996,2:1140-1143.〔4〕Hayashi,TsuhiyaH,YaatN