DB37-T 3754-2019 动物产品中马、驴、骡源性成分的定性检测方法　实时荧光PCR法-（高清版）

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DB37山 东 省 地 方 标 准DB37/T3754—2019Qualitativedetectionofhorse,donkeyandmulederivedmaterialsinfeedandrelativeproducts—Qualitativedetectionofhorse,donkeyandmulederivedmaterialsinfeedandrelativeproducts—Real-timePCRmethod2019-12-052020-01-05山东省市场监督管理局发布前 言本标准按照GB/T1.1—2009的规则起草。本标准由山东省市场监督管理局提出、归口并组织实施。本标准为首次发布。引 言动物相关产品中骡源性成分的检测目前没有国家标准和相关行业标准，且现有的基于实时定量PCR技术的驴、马源性成分鉴定无法排除骡源性成分的干扰。动物产品中马、驴、骡源性成分的定性检测方法实时荧光PCR法范围本标准不适用于动物深加工产品（如阿胶及其附属产品）的检测，本方法的最低检出限（LOD）为100mg/kg。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测SN/T1193基因检测实验室技术要求3术语和定义3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1荧光定量PCR技术在PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号强弱的变化来即时测定特异性产物的量，并据此推断目的基因的初始量，不需要取出PCR产物进行分离。3.2Ct值每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。3.3已知来源于单一动物源性成分的样品（4原理TaqManPCR（creatinekinase（）DNAPCRDNAPCRPCRPCR0.01g（10μL、20μL、100μL、1000μL）5.84℃，-20PCR6试剂和材料PCR6试剂和材料GB/T27403SN/T1193GB/T6682DNA检测用引物和Taqman1）表1检测用引物和Taqman推荐赛默飞世尔科技（中国）有限公司合成的Taqman-MGB探针，或等效试剂。名称序列（5’—3’）目的基因内参照5’端引物内参照3’端引物内参照探针F:5’-TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA-3’R:5’-AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT-3’P:5’-FAM-CCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACC-TRAMA-3’真核生物18SrRNA基因马成分5’端引物马成分3’端引物马成分探针F:5'-CCTGGTATGGAAACATTGGAATC-3'R:5'-CTTGGAGAGCGAGCACAGC-3'P:5’-FAM-CCGGAAACAAAGTGAG-MGBNFQ-3’马核基因组ckm基因驴成分5’端引物驴成分3’端引物驴成分探针F:5'-CCTGGTATGGAAACATCGGAATC-3'R:5'-CTCGGAGAGCGAGCACAGC-3'P:5’-FAM-CCCGACACAAAGTGAG-MGBNFQ-3’驴核基因组ckm基因CTAB55mmol/LCTAB，1.4mol/LNaCl，20mmol/LEDTA，100mmol/LTrispH20minTE10mmol/LTris-HCl(pH8.0)，1mmol/LEDTA(pH8.0K：20mg/μLRNA5μg/μLTris6.12706.132PCR）PremixExTaq、南AceQqPCRProbeMasterMixDNADNA称取0.2g～0.32mL1000μLCTAB40μLK，6530min，10min12000g10min，吸取1mL2mL离50025:24:112000离心12min，12000g离心10min65DNA5μLRNA酶，37℃温浴30minμL24:11200012min12000g离心10min，12000g离心min50μLTEDNA，-20DNA提取也可使用等效的DNA提取试剂盒替代，推荐南京诺唯赞生物科技有限公司的FastPureTMTissueDNAIsolationMiniKit，或等效试剂盒。DNA取适量的DNA模板溶液加双蒸水稀释一定倍数后，使用紫外分光光度计测定260nm和280nm处的吸光值A260和A280，DNA浓度计算按式（1）计算： C=A×N×50 (1)式中：C——DNA（ng/μL）；A——260nmN——核酸稀释倍数；50——吸光值A260为1时，相对应双链DNA的浓度常数。当A260/A280比值在1.8～2.0之间时，DNA模板适宜荧光定量PCR扩增。DNAPCRDNAPCRPCR实时荧光PCR反应体系见表2。表2实时荧光PCR反应体系试剂成分体积（单位：μL）2PCR引物F（10μM）引物R（10μM）P（5μM）样品DNA（10ng/μL～100ng/μL）ddH2012.51111补至25PCR95℃预变性5min；95℃变性5s，60℃退火30s，45个循环。DNADNADNADNA以下条件有一条不满足时，实验视为无效，需重新进行实验：Ct40.0；Ct40.0；Ct＜30.0；Ct＜30.0；Ct30.0在符合第9部分的情况下，被检样品进行检测时：Ct≤35.0Ct≤35.0Ct40.035.0＜CtDNADNATEPCRPCRCt40.0CtPCRDNA。检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T27403中的规定执行。附录A（资料性附录）扩增产物序列马ckmPCRDNA（93bp）F P1 AAACATTGGAATCAGCGCCGGAAACAAAGTGAGCTCTCGGGACCTGACAG61 TGGT