pcr聚合酶链式反应课件

第一章PCR技术原理2021/7/131第一章PCR技术原理2021/7/131定义：PCR技术又称聚合酶链式反应（polymerasechainreaction)，是通过模拟体内DNA复制的方式，在体外选择性地将DNA某个特殊区域扩增出来的技术。PCR技术:2021/7/132PCR技术:2021/7/132PCR概念的提出1971年，美国麻省理工(MIT)教授、1968年诺贝尔医学奖得主Khorana提出“经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。1983，KaryMullis1993年获得诺贝尔奖2021/7/133PCR概念的提出1971年，美国麻省理工(MIT)教授、19引物引物Mullis的构思DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段2021/7/134引物引物Mullis的构思DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA技术难点Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段。不耐高温。2021/7/135技术难点Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNAthermusaquaticusTaqDNA聚合酶的发现1988年Saiki等从温泉（

Hot

spring）中分离的一株水生嗜热杆菌(thermusaquaticus)中提取到一种耐热DNA聚合酶。2021/7/136thermusaquaticusTaqDNA聚合酶的发现

①耐高温，②在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。③大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度(2.0Kb)。酶命名为TaqDNA多聚酶(TaqDNA

Polymerase)。此酶的发现使被PCR广泛应用。在

1989

年，Science

将PCR中的TaqDNA多聚酶命名为当年的风云分子

(Molecule

of

the

year)

TaqDNA聚合酶优点2021/7/137TaqDNA聚合酶优点2021/7/1371、PCR技术的基本原理在微量离心管中,加入适量的缓冲液,微量的模板DNA,四种脱氧单核苷酸,耐热性多聚酶,一对合成DNA的引物,通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环的反应过程,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍;扩增了特异区段的DNA带。

PCR技术的基本原理和工作方式2021/7/1381、PCR技术的基本原理在微量离心管中,加入适量的缓冲液,模板DNA95℃2.PCR工作方式2021/7/139模板DNA95℃2.PCR工作方式2021/7/139PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点95℃50℃引物1引物2DNA引物2021/7/1310PCR的基本原理PCR反应条件95℃50℃引物1引物2DNAPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50℃引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶2021/7/1311PCR的基本原理PCR反应条件50℃引物1引物2DNA引物7PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第1轮结束95℃第2轮开始2021/7/1312PCR的基本原理PCR反应条件72℃第1轮结束95℃第2轮开PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaq2021/7/1313PCR的基本原理PCR反应条件95℃50℃72℃TaqTaqPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第2轮结束2021/7/1314PCR的基本原理PCR反应条件72℃第2轮结束2021/7/PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增2021/7/1315PCR的基本原理PCR反应条件模板DNA第1轮扩增第2轮扩增3.PCR基本材料

①模板：单链或双链DNA

②引物：16-30bp合成的寡核苷酸

③DNA聚合酶：耐热的DNA聚合酶④底物：四种脱氧三磷酸核苷（dNTP:dATP、dTTP、dCTP、dGTP)

⑤

Mg2+：DNA聚合酶的激活剂

2021/7/13163.PCR基本材料2021/7/13164.PCR反应程序⑴94~96℃30’’-3’预变性（使模板DNA充分变性）⑵94℃30’’变性⑶50-60℃30’’-1’复性（使引物与模板充分退火）⑷72℃n’(按1’扩增1kb计算）延伸⑹72℃3-7’总的延伸（使产物延伸完整）⑺4-10℃保存⑸

25-35个循环2021/7/13174.PCR反应程序⑴94~96℃30’’-3’预5.PCR要素解析1）复性和延伸温度

复性的温度是PCR扩增是否顺利的关键因素，通常在50-60℃之间。具体的温度主要由引物的Tm值决定（低于Tm值2-3℃）。延伸温度绝大多数设定为72℃。如果复性的温度很高，可以将延伸温度和复性温度设置成同一温度，变成二步法PCR。2）反应时间

变性一般使用30秒钟，如果模板的G+C含量较高，或直接用细胞做模板，变性时间可适当延长。复性时间有30秒种一般是足够的。延伸时间由扩增产物的大小决定，一般采用1kb用1分钟来保证充足的时间。

2021/7/13185.PCR要素解析1）复性和延伸温度2021/7/13185.PCR要素解析3）循环次数循环次数主要与模板的起始数量有关，循环数通常为25～35次。

平台效应（plateaueffect）：PCR扩增过程后期出现的产物的积累按减弱的指数速率增长的现象。原因：底物和引物的浓度已经降低，dNTP和DNA聚合酶的稳定性或活性降低，产生的焦磷酸会出现末端产物抑制作用，非特异性产物或引物的二聚体出现非特异性竞争作用，扩增产物自身复性，高浓度扩增产物变性不彻底。

2021/7/13195.PCR要素解析3）循环次数2021/7/13195.PCR要素解析4）PCR反应液的配制顺序

最后加入DNA聚合酶。早期的PCR仪没有带加热的盖子，要求在反应液上覆盖一层矿物油，防止水分蒸发。

热启动（hotstart）PCR操作方式可较好解决非特异性扩增的问题。

2021/7/13205.PCR要素解析4）PCR反应液的配制顺序2021/7

5.PCR要素解析5）各种成分浓度作用：①缓冲液：提供合适的PH值和DNA聚合酶的激活剂10mMTris·HCl（pH8.3-9.0），1.5mM

MgCl2，50mMK+

②dNTP（底物）：等摩尔浓度的4种dNTP（即

dATP、dTTP、dCTP和dGTP），终浓度一般为200mM（即饱和浓度），dNTP的浓度会影响扩增的产量、特异性和忠实性。

③引物：

1μM/L

2021/7/13215.PCR要素解析5）各种成分浓度作用：2021/7/135.PCR要素解析④模板：单、双链DNA均可。

模板的数量会直接影响扩增的效果。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。⑤DNA聚合酶：最常用的是TaqDNA聚合酶，最适反应温度72℃。

PfuDNA聚合酶：是目前使用最广泛的具有3‘-5’外切活性的PCR酶，目前为止错配率最低的高温DNA聚合酶。

酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。2021/7/13225.PCR要素解析④模板：单、双链DNA均可。2021/7①长度：至少16bp，通常为18-25bp。更短的引物一般会降低扩增的特异性，但会提高扩增的有效性②引物的解链温度：两个引物之间的Tm值差异最好在2-5℃。对于小于20个碱基的引物其Tm值可用简易公式计算，即Tm=4（G+C）+2（A+T）。③避免引物内部或引物之间形成引物二聚体（特别是引物的3’端）。④G+C含量：尽量控制在40%至60%之间，4种碱基的分布应尽可能均匀。尽量避免嘌呤或嘧啶的连续排列，以及T在3‘末端的重复排列。⑤引物的3'末端最好是G或C，但不要GC连排。

5.PCR要素解析：引物设计2021/7/1323①长度：至少16bp，通常为18-25bp。更短的引6.PCR技术特点1）高度的灵敏性30轮循环扩增量达230个拷贝（109拷贝）PCR产物每轮循环增加一倍2021/7/13246.PCR技术特点1）高度的灵敏性30轮循环扩增量达230引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键。引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。引物引物6.PCR技术特点1）特异性2021/7/1325引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关3）操作简便易行PCR扩增法,只需要数小时,就可以用电泳法检出1μg基因组DNA中仅含数个拷贝的模板序列。

6.PCR技术特点2021/7/13263）操作简便易行6.PCR技术特点2021/7/13264）用途广泛生命学科医学工程遗传工程疾病诊断法医学考古学6.PCR技术特点2021/7/13274）用途广泛生命学科6.PCR技术特点2021/7/131、2×TaqPCRMasterMix2、DNA模板3、引物：本次实验所用材料2021/7/13281、2×TaqPCRMasterMix本次实验所用材料2PCR反应体系试剂体积（µl）2×TaqPCRMasterMix12.5P125uM1P225uM1DNA模板100ng1ddH2Oto252021/7/1329PCR反应体系试剂体积（µl）2×TaqPCRMastePCR反应程序95℃5min1个循环95℃30sec35个循环60℃30sec72℃30sec72℃10min1个循环4℃hold

2021/7/1330PCR反应程序95℃5min1个循环95℃30sec35个循琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。其分析原理与其他支持物电泳最主要区别是：它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。2021/7/1331琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方琼脂糖琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。但由于其孔径相当大，对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道，现广泛应用于核酸的研究中2021/7/1332琼脂糖琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分电荷效应琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。但由于其孔径相当大，对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道，现广泛应用于核酸的研究中2021/7/1333电荷效应琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子筛效应DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速率向正极方向移动。2021/7/1334分子筛效应DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效线状DNA片段分离的有效范围与琼脂糖凝胶浓度关系琼脂糖凝胶的百分浓度（%）线状DNA分子的有效范围（Kb）0.360~50.620~10.710~0.80.97~0.51.26~0.41.54~0.22.03~0.12021/7/1335线状DNA片段分离的有效范围与琼脂糖凝胶浓度关系琼脂糖凝胶的实验材料【材料】1.琼脂糖2.10mg/mlEB3.marker4.TAETris242gCH3COOH57.1ml0.5MEDTA（pH8.0）100mlddH2Oto1000ml2021/7/1336实验材料【材料】Tris242gCH3COOH57.1ml0实验步骤【步骤】1、称1.5g琼脂糖，加100ml电泳缓冲液（1×TAE）加热熔化。2、胶液冷却至60℃时，加入4μlEB，小心混匀，缓慢倒入制胶模具中，在胶一端插上梳子。3、待胶凝固后，拨出梳子，将模具置于水平电泳槽中，加入1×TAE，让液面高于胶面至少1mm。4、上样。5、接通电泳仪电源，1-5V/cm电压（一般80~100V），开始电泳。6、根据指示剂迁移位置，判断是否终止电泳。切断电源后，取出凝胶，使用凝胶成像仪进行观察或拍照。2021/7/1337实验步骤【步骤】2021/7/1337琼脂糖凝胶电泳DNA回收2021/7/1338琼脂糖凝胶电泳DNA回收2021/7/1338实验原理离心吸附柱纯化DNA的原理就是在离心吸附柱内使用一种特殊的硅基质滤膜，这种滤膜在低PH值、高浓度盐（盐酸胍，NaI,NaClO4等）存在的条件下，可以选择性吸附DNA片段，而蛋白质和其它杂质不会被吸附。再通过一系列漂洗、离心等步骤将残留的引物、核苷酸、蛋白质等杂质去除。最后用低盐、高PH值的洗脱缓冲液将纯净的DNA从滤膜上洗脱下来。利用硅基质膜的过滤吸附操作，大大简化了核酸纯化过程，提供了一种快速、高通量的纯化方式。除单管离心柱外，已经有96孔板、384孔板等核酸纯化产品。目前，硅基质膜吸附法已经成为目前核酸分离纯化最主流的技术。通过该技术纯化的DNA片段可直接用于的酶切、连接、测序、标记和杂交等各种常规分子生物学操作。2021/7/1339实验原理离心吸附柱纯化DNA的原理就是在离心吸附柱内使用一种试剂盒组成及储存方法名称用途溶胶/结合液DA溶胶（红色）结合液DD无色与DA混合后变为黄色洗涤液W1洗涤液去盐液W2洗脱盐离子（75%EtOH）洗脱液EB洗脱DNA吸附柱AC结合DNA收集管（2ml）收集废液2021/7/1340试剂盒组成及储存方法名称用途溶胶/结合液DA溶胶（红色实验步骤2021/7/1341实验步骤2021/7/13412021/7/13422021/7/1342注意事项切胶回收DNA时，应尽量使用能量较低的长波长紫外线，并缩短操作时间，以减少紫外线对DNA的损伤。第一次使用前先在漂洗液W2中加入指定量的无水乙醇，加入后及时做好标记，以免多次加入。各种溶液使用后应及时盖紧，以避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化。所有操作在室温完成。若溶液沾染皮肤、眼睛时，立即用大量清水冲洗。适当减小洗脱体积可提高回收DNA的浓度。但体积小于30μl将降低洗脱效率。2021/7/1343注意事项切胶回收DNA时，应尽量使用能量较低的长波长紫外线，凝胶电泳检测2021/7/1344凝胶电泳检测2021/7/1344问题？问题？第一章PCR技术原理2021/7/1346第一章PCR技术原理2021/7/131定义：PCR技术又称聚合酶链式反应（polymerasechainreaction)，是通过模拟体内DNA复制的方式，在体外选择性地将DNA某个特殊区域扩增出来的技术。PCR技术:2021/7/1347PCR技术:2021/7/132PCR概念的提出1971年，美国麻省理工(MIT)教授、1968年诺贝尔医学奖得主Khorana提出“经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。1983，KaryMullis1993年获得诺贝尔奖2021/7/1348PCR概念的提出1971年，美国麻省理工(MIT)教授、19引物引物Mullis的构思DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段2021/7/1349引物引物Mullis的构思DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA技术难点Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段。不耐高温。2021/7/1350技术难点Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNAthermusaquaticusTaqDNA聚合酶的发现1988年Saiki等从温泉（

Hot

spring）中分离的一株水生嗜热杆菌(thermusaquaticus)中提取到一种耐热DNA聚合酶。2021/7/1351thermusaquaticusTaqDNA聚合酶的发现

①耐高温，②在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。③大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度(2.0Kb)。酶命名为TaqDNA多聚酶(TaqDNA

Polymerase)。此酶的发现使被PCR广泛应用。在

1989

年，Science

将PCR中的TaqDNA多聚酶命名为当年的风云分子

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year)

TaqDNA聚合酶优点2021/7/1352TaqDNA聚合酶优点2021/7/1371、PCR技术的基本原理在微量离心管中,加入适量的缓冲液,微量的模板DNA,四种脱氧单核苷酸,耐热性多聚酶,一对合成DNA的引物,通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环的反应过程,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍;扩增了特异区段的DNA带。

PCR技术的基本原理和工作方式2021/7/13531、PCR技术的基本原理在微量离心管中,加入适量的缓冲液,模板DNA95℃2.PCR工作方式2021/7/1354模板DNA95℃2.PCR工作方式2021/7/139PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点95℃50℃引物1引物2DNA引物2021/7/1355PCR的基本原理PCR反应条件95℃50℃引物1引物2DNAPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50℃引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶2021/7/1356PCR的基本原理PCR反应条件50℃引物1引物2DNA引物7PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第1轮结束95℃第2轮开始2021/7/1357PCR的基本原理PCR反应条件72℃第1轮结束95℃第2轮开PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaq2021/7/1358PCR的基本原理PCR反应条件95℃50℃72℃TaqTaqPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第2轮结束2021/7/1359PCR的基本原理PCR反应条件72℃第2轮结束2021/7/PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增2021/7/1360PCR的基本原理PCR反应条件模板DNA第1轮扩增第2轮扩增3.PCR基本材料

①模板：单链或双链DNA

②引物：16-30bp合成的寡核苷酸

③DNA聚合酶：耐热的DNA聚合酶④底物：四种脱氧三磷酸核苷（dNTP:dATP、dTTP、dCTP、dGTP)

⑤

Mg2+：DNA聚合酶的激活剂

2021/7/13613.PCR基本材料2021/7/13164.PCR反应程序⑴94~96℃30’’-3’预变性（使模板DNA充分变性）⑵94℃30’’变性⑶50-60℃30’’-1’复性（使引物与模板充分退火）⑷72℃n’(按1’扩增1kb计算）延伸⑹72℃3-7’总的延伸（使产物延伸完整）⑺4-10℃保存⑸

25-35个循环2021/7/13624.PCR反应程序⑴94~96℃30’’-3’预5.PCR要素解析1）复性和延伸温度

复性的温度是PCR扩增是否顺利的关键因素，通常在50-60℃之间。具体的温度主要由引物的Tm值决定（低于Tm值2-3℃）。延伸温度绝大多数设定为72℃。如果复性的温度很高，可以将延伸温度和复性温度设置成同一温度，变成二步法PCR。2）反应时间

变性一般使用30秒钟，如果模板的G+C含量较高，或直接用细胞做模板，变性时间可适当延长。复性时间有30秒种一般是足够的。延伸时间由扩增产物的大小决定，一般采用1kb用1分钟来保证充足的时间。

2021/7/13635.PCR要素解析1）复性和延伸温度2021/7/13185.PCR要素解析3）循环次数循环次数主要与模板的起始数量有关，循环数通常为25～35次。

平台效应（plateaueffect）：PCR扩增过程后期出现的产物的积累按减弱的指数速率增长的现象。原因：底物和引物的浓度已经降低，dNTP和DNA聚合酶的稳定性或活性降低，产生的焦磷酸会出现末端产物抑制作用，非特异性产物或引物的二聚体出现非特异性竞争作用，扩增产物自身复性，高浓度扩增产物变性不彻底。

2021/7/13645.PCR要素解析3）循环次数2021/7/13195.PCR要素解析4）PCR反应液的配制顺序

最后加入DNA聚合酶。早期的PCR仪没有带加热的盖子，要求在反应液上覆盖一层矿物油，防止水分蒸发。

热启动（hotstart）PCR操作方式可较好解决非特异性扩增的问题。

2021/7/13655.PCR要素解析4）PCR反应液的配制顺序2021/7

5.PCR要素解析5）各种成分浓度作用：①缓冲液：提供合适的PH值和DNA聚合酶的激活剂10mMTris·HCl（pH8.3-9.0），1.5mM

MgCl2，50mMK+

②dNTP（底物）：等摩尔浓度的4种dNTP（即

dATP、dTTP、dCTP和dGTP），终浓度一般为200mM（即饱和浓度），dNTP的浓度会影响扩增的产量、特异性和忠实性。

③引物：

1μM/L

2021/7/13665.PCR要素解析5）各种成分浓度作用：2021/7/135.PCR要素解析④模板：单、双链DNA均可。

模板的数量会直接影响扩增的效果。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。⑤DNA聚合酶：最常用的是TaqDNA聚合酶，最适反应温度72℃。

PfuDNA聚合酶：是目前使用最广泛的具有3‘-5’外切活性的PCR酶，目前为止错配率最低的高温DNA聚合酶。

酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。2021/7/13675.PCR要素解析④模板：单、双链DNA均可。2021/7①长度：至少16bp，通常为18-25bp。更短的引物一般会降低扩增的特异性，但会提高扩增的有效性②引物的解链温度：两个引物之间的Tm值差异最好在2-5℃。对于小于20个碱基的引物其Tm值可用简易公式计算，即Tm=4（G+C）+2（A+T）。③避免引物内部或引物之间形成引物二聚体（特别是引物的3’端）。④G+C含量：尽量控制在40%至60%之间，4种碱基的分布应尽可能均匀。尽量避免嘌呤或嘧啶的连续排列，以及T在3‘末端的重复排列。⑤引物的3'末端最好是G或C，但不要GC连排。

5.PCR要素解析：引物设计2021/7/1368①长度：至少16bp，通常为18-25bp。更短的引6.PCR技术特点1）高度的灵敏性30轮循环扩增量达230个拷贝（109拷贝）PCR产物每轮循环增加一倍2021/7/13696.PCR技术特点1）高度的灵敏性30轮循环扩增量达230引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键。引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。引物引物6.PCR技术特点1）特异性2021/7/1370引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关3）操作简便易行PCR扩增法,只需要数小时,就可以用电泳法检出1μg基因组DNA中仅含数个拷贝的模板序列。

6.PCR技术特点2021/7/13713）操作简便易行6.PCR技术特点2021/7/13264）用途广泛生命学科医学工程遗传工程疾病诊断法医学考古学6.PCR技术特点2021/7/13724）用途广泛生命学科6.PCR技术特点2021/7/131、2×TaqPCRMasterMix2、DNA模板3、引物：本次实验所用材料2021/7/13731、2×TaqPCRMasterMix本次实验所用材料2PCR反应体系试剂体积（µl）2×TaqPCRMasterMix12.5P125uM1P225uM1DNA模板100ng1ddH2Oto252021/7/1374PCR反应体系试剂体积（µl）2×TaqPCRMastePCR反应程序95℃5min1个循环95℃30sec35个循环60℃30sec72℃30sec72℃10min1个循环4℃hold

2021/7/1375PCR反应程序95℃5min1个循环95℃30sec35个循琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。其分析原理与其他支持物电泳最主要区别是：它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。2021/7/1376琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方琼脂糖琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。但由于其孔径相当大，对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道，现广泛应用于核酸的研究中2021/7/1377琼脂糖琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分电荷效应琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。但由于其孔径相当大，对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道，现广泛应用于核酸的研究中2021/7/1378电荷效应琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子筛效应DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速率向正极方向移动。2021/7/1379分子筛效应DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效线状DNA片段分离的有效范围与琼脂糖凝胶浓度关系琼脂糖凝胶的百分浓度（%）线状DNA分子的有效范围（Kb）0.360~50.620~10.710~0.8