园艺学实验技术思考题及答案

园艺学实验技术思考题及答案园艺学实验技术思考题及答案园艺学实验技术思考题及答案xxx公司园艺学实验技术思考题及答案文件编号：文件日期：修订次数：第1.0次更改批准审核制定方案设计，管理制度1、请阐明PCR的原理和引物设计的注意事项原理：PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍注意事项：①引物长度：15-30bp，常用20bp左右；②引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增至10kb的片段；③引物碱基：G+C含量为40-60%为宜，ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸成串排列；④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3’端互补；⑤引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基应严格要求配对；⑥引物中最好有合适的酶切位点；⑦引物应与核酸序列数据库的其他序列无明显同源性；⑧序列Tm为55-60℃2、试述Southern技术的原理，操作和注意事项原理：将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。操作：①基因组酶切；②用琼脂糖凝胶电泳队DNA片段按分子量大小分离；③将DNA片段在琼脂糖凝胶电泳变性成单链后，再转移到适当的故乡支持物上并与之结合（即转膜）；④探针与膜上DNA杂交；⑤检测注意事项：①将凝胶中和至中性时，要测定pH，防止凝胶的碱性破坏硝酸纤维膜；②要注意赶走凝胶和滤纸及硝酸纤维膜之间的气泡3、试述Northern技术的原理操作和注意事项原理：在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。操作：①RNA的提取；②RNA变性电泳；③RNA转移和固定（即转膜）；④探针与膜上的RNA杂交；⑤检测注意事项：①用于RNA电泳、转膜的所有器材均须预处理以除去RNAse，以免样品的降解；②转膜时，注意赶走气泡4、试述质粒提取的原理和注意事项原理：碱裂解法提取质粒利用的是共价闭合环状质粒DNA与线状的染色体DNA片段在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于这个狭窄的范围内，线状的DNA双螺旋结构解开变性，在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键虽然断裂，但两条互补链彼此依然相互盘绕而紧密地结合在一起。当加入的醋酸钾高盐缓冲液使pH降低后，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链迅速而准确地复性，而线状的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，不能迅速而准确地复性，它们缠绕形成网状结构。通过离心，线状的染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来，而闭合环状质粒DNA却留在上清液中。注意事项：（碱裂解法）①加入溶液2后不要剧烈振荡，只需轻轻颠倒几次离心管；②加入溶液2后，复性时间不宜过长，一般是5分钟，否则会使染色体复性；③在用苯酚、氯仿抽提时应用TE缓冲液将原溶液的体积扩大，一般是200～300微升，以减少DNA的损失；④在加入酚氯仿的步骤中，最好用未高温灭菌的离心管，因为高温过程中可能使管口变形，使得振荡混匀过程中酚氯仿容易溢出；⑤溶液2不可冷冻,现用现配；⑥提取过程应尽量在低温环境进行；⑦反应中加入的研浓度要控制好5、试述载体构建的流程和注意事项流程：①克隆目的基因片段：设计引物，进行目的基因片段的pcr，连T载体，转化大肠杆菌，提质粒，通过pcr或酶切鉴定；②酶切：用相同的酶酶切插入目的片段的T载体及表达载体，回收目的片段与表达载体的大片段；③连接：连接回收的目的片段与表达载体的大片段，重组子转化大肠杆菌，提取质粒，酶切鉴定注意事项：①设计引物时酶切位点前加上适当的保护碱基，否则将不能有效酶切；②PCR产物最好纯化后再进行酶切，酶切时注意内切酶最后加入，每次取样更换枪头，用完后立即放入-20度冰箱；酶量不超过反映总体系的10%；多种酶消化时若缓冲液条件相同，可同时加入；否则，先做低温或低盐的酶消化，再做高温或高盐的酶消化连接时注意DNA片段的摩尔数应控制在载体DNA摩尔数的3~10倍;平端的连接效率比粘性末端要低得多，T4DNA连接酶的浓度和外源DNA及载体DNA浓度要适当加大。6、试述细胞全能性的概念，以及其对分子育种的意义概念：多细胞生物中的每个体细胞都含有该生物的整套遗传物质，在适宜条件下具有发育成完整个体的潜力。意义：①体细胞克隆变异是指植物组织和细胞培养物在培养过程中产生的变异。体细胞克隆变异可以应用在抗病、抗除草剂育种上。在耐盐、耐低温、抗重金属等突变体方面也开展了工作。②单倍体细胞培养及育种利用：花粉培养是指把花粉从花药中分离出来，以单个花药粒作为外植体进行离体培养的技术。优点：花粉已是单倍体细胞，发育成的小植株都是单倍体植株或双单倍体，不含有因干扰而形成的体细胞植株；缺点：培养难度大③幼胚培养与远缘杂交育种：植物胚胎培养是指使胚及具有胚器官（如子房、胚珠）在离体无菌培养条件下发育成幼苗的技术，是植物远缘杂交育种的重要辅助手段，克服了远缘杂交种胚的早期败育现象，提高远缘杂交种的成苗率，使种子无生活力的植株获得后代，使胚发育不全的植物获得后代，克服种子休眠，提早结实，缩短育种周期，克服柑橘类合子胚不能生长现象。7、试述琼脂糖凝胶电泳的原理原理：许多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可电离基团，它们在某个特定的pH值下可以带正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷极性相反的电极方向移动，即电泳过程。琼脂糖主要在电泳中作为一种固体支持基质。琼脂糖之间以分子内和分子间氢键形成较为稳定的交联结构，这种交联的结构使琼脂糖凝胶有较好的抗对流性质。琼脂糖凝胶的孔径可以通过琼脂糖的最初浓度来控制，低浓度的琼脂糖形成较大的孔径，而高浓度的琼脂糖形成较小的孔径。8、石蜡包埋过程应注意的问题①包埋前应该将镊子和溶化的石蜡放在恒温箱中，温度65-70℃为宜；②材料应尽量放在石蜡底部，使石蜡完全淹没材料；③材料放好后，轻轻吹一口气，是石蜡的表面形成一层膜，再放入冷水中，使石蜡迅速冷却；④控制温度，温度过高石蜡中容易出现气泡，温度过低使石蜡在操作过程中凝固；⑤石蜡使用前要过滤，除去杂质，用滤纸过滤比纱布效果好9、投射电镜主要由哪三大系统组成其中每个系统主要包括哪些部分电子光学系统：电子枪、磁电子透镜、样品室、观察记录仪；真空系统：真空泵、阀门、真空管道、检测仪；成像系统：物镜、中间镜、摄像镜10、简述投射电镜的成像原理电子束在真空条件下经高压加速后形成快速电子束流，这时不带样品信息的入射电子射线与样品发生作用。由于样品的厚度和质量有差异，使信号产生差异。电子束信号经过磁透镜构成的物镜，获得被检物的正确放大像。最后再经投影镜再次放大，形成观察和拍摄的最终差异。11、简述普通超薄切片下样品制备的基本过程①取材：选择有代表性、新鲜健康的材料，并且要求小而精、保持完整，要求动作快，1min内进入固定相；②杀死、固定和保存：一般选择杀死、固定和保存剂兼作的化学药品，常用甲醛。杀死过程应迅速，尽量使材料保持其自然状态；③漂洗与脱水：用固定液相应的缓冲液清洗。用脱水剂置换出材料中的水分，使材料变硬，形状更固定，常用脱水剂有酒精和丙酮。脱水过程应从低浓度开始，逐渐更换到高浓度；④透明：使用一种既能与脱水剂又能与包埋剂相混合的溶剂，常用透明剂有二甲苯和氯仿；⑤浸透和包埋：经透明后，用石蜡浸透，除去材料中的二甲苯，而代之以石蜡。常用的包埋剂有环氧树脂、乙二醇甲基丙烯酸酯；⑥切片：先用石蜡修剪成六面体，再同切片机切片；⑦粘片：用粘贴剂将石蜡切片粘贴于载玻片上；⑧染色：染色前，将石蜡溶去，用二甲苯去蜡，在逐步移入酒精或者水中，染色剂一般用番红-固绿二重燃料；⑨固封：固封剂有加拿大树胶、甘油胶和糖浆等12、制备扫描电镜的样品有哪些干燥方法①空气干燥法：又称自然干燥法，将经过脱水的样品，让其暴露在空气中使脱水剂逐渐挥发干燥；②临界点干燥法：利用物质在临界状态时，其表面张力等于零的特性，使样品的液体完全汽化，并以气体方式排掉，来达到完全干燥的目的；③冷冻干燥法：将经过冷冻的样品置于高真空中，通过升华除去样品中的水分或脱水剂的过程。冷冻干燥法有两种，即含水样品直接冷冻干燥和样品脱水后冷冻干燥；13、制备免疫电镜的样品时，为什么要进行对照实验样品的制备过程比较复杂，会受到多种因素的影响，如抗原的活性、微环境的成分、抗体的特异性、抗体稀释的比例、各种溶液（固定祥和缓冲液）成分、pH、投射压、温度、作用时间和电子染色的效应等。为了排除干扰因素的影响，增加实验的可靠性，就需要根据具体情况进行对照实验。14、简述盐析和透析的基本原理和技术要点盐析的基本原理：高浓度盐的水合作用破坏了蛋白质的水化膜，使蛋白质分子相互聚集而沉淀。不同蛋白质带电荷水化程度不同，盐浓度不同，可将不同蛋白质加以分离。盐析的技术要点：大多数蛋白质用55%硫酸铵沉淀，80%、85%硫酸铵是最大沉淀，将蛋白质溶液烧杯放入有冰块的大烧杯中，用磁力搅拌器搅拌，加入硫酸铵至饱和，5-10min完成。搅拌10-30min，10000xg离心10min，弃上清，沉淀悬浮于1-2倍缓冲液中，透析、超滤、脱盐柱除去硫酸铵。透析的基本原理：利用蛋白质分子不透过半透膜的性质，通过不断更换透析袋外侧的溶液将蛋白与其他小分子物质分离。透析的技术要点：新购买的透析袋含甘油等杂质，先用水煮10min，后用70%酒精冰箱保存。将预处理过的透析袋一端扎紧，用移液管或漏斗将待透析液移入透析袋中，不能装满，留一半左右空间，扎紧口，浸入装有大量纯净溶剂的量筒或玻璃缸中。透析液与纯净溶液在搅拌时体积比为1：10，静态体积比1：20。15、什么叫电泳简述电泳的基本原理电泳：在外电场作用下，带电颗粒向与其电性相反的电极移动。基本原理：溶液中的蛋白质具有许多可接力的酸性基团和碱性基团，在一定pH值条件下，就会解离带电。带电性质和电荷多少决定于蛋白质分子的性质、溶液pH及离子强度。带电的蛋白质分子在电场中会朝着自己所带电荷相反的电极方向移动，根据带电性质不同有不同的迁移率，因此可用于分离不同的蛋白质。16、原子吸收分光光度法与火焰光度法有何异同点主要应用于哪些方面共同点：都是发射出特定波长的光，通过单色器分出该元素的特征谱线，并用光电检测器测定其发射强度。不同点：前者测定范围广，灵敏度高，选择性强，操作简便、快速，重复性好。后者只能测定无机元素，精确性受到很多因素干扰。应用：前者用于植物分析、肥料分析、土壤分析、食品饲料分析和生物化学分析；后者用于无机元素特别是钙、镁、锰等，土壤和植物的元素分析，生物大分子、细胞和组织中金属元素的分析。17、在采用凝胶电泳法测定蛋白质相对分子量时，为何向电泳体系中加入SDSSDS是一种阴离子表面活性剂，带有大量负电荷。当与蛋白质结合后，使蛋白质失去原有带电状态而只带负电荷，消除了蛋白质间天然的电荷差异；同时引起蛋白质构想的改变，均形成长椭圆棒状，消除了蛋白质间的形态差异。这样的蛋白质SDS复合物在凝胶中的迁移率只与椭圆棒的长度即蛋白质的相对分子量的函数有关，有利于蛋白质的分离。18、相对离心力为30000xg，转头平均半径为10cm，求转速rRCF=×10-5×R×rpm2rpm2=30000×105/×10)rpm=19、简述测定过氧化物酶活性的生理意义过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶，它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有密切关系。在植物生长发育股过程中他的活性不断发生变化。因此测量这种酶的活性，可以反映特定时期植物体内代谢的变化。20、免疫印迹杂交技术（WesternBlot）的工作原理应用在哪些方面工作原理：与Southern或Northern杂交方法类似，但Western杂交采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，探针是抗体，显色用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多态类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体其免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射性自显影以检测电泳分离的特异目的基因表达的蛋白成分。应用：抗原的纯化和浓缩，检测靶蛋白的有无，目的基因是否表达的鉴定，该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。21、TTC法快速测定种子生命力的理论依据是什么在实验操作中应注意些什么理论依据：TTC的氧化态是无色的，可被氢还原成红色不溶性的TTF。活的种子有呼吸作用，而呼吸作用中脱氢酶的活动可使无色的TTC还原成红色的TTF。应用TTC的水溶液浸泡活的种子，可使种胚显红色。种子生命力越强，代谢活动越旺盛，种胚被染成红色的程度越深；而种胚生命力衰退或部分丧失生活力则染色较浅或只有部分被染色。因此，可以根据TTC快速测定种子的生命力。注意事项：①TTC溶液浓度一般为%，最好现配现用，贮藏要保存在棕色瓶中，阴凉黑暗处；若溶液变色则不可再用；②染色温度一般为25-35℃；③有生活力的种子应具有的特征：种胚完整，发育良好，能整个染成鲜红色，允许子叶有小部分的坏死，但不能在胚中轴和子叶连接处，胚根尖也可以有小部分的坏死，但其它的部位完好；④无生活力的种子应具有的特征：种胚全部或大部分不染色，胚根不染色的部位不仅在根尖，子叶不染色或丧失机能的组织超过1/2，子叶与胚中轴的连接处或在胚根上有坏死的部分；胚根受伤以及发育不良、未成熟的种子；⑤测定不同作物种子的生活力，要选择适当的染色试剂、试剂浓度、染色时间等22、层析法按照层析过程的机理分哪几类各有何特点①吸附层析：利用吸附剂表面对不同组分吸附性能的差异达到分离鉴定目的；②分配层析：利用不同组分在流动相合固定相之间的分配系数（或溶解度）不同而使之分离；③离子交换层析：利用离子交换剂上的可交换离子与周围介质中被分离的各种离子间的亲和力不同，经过交换平衡达到分离目的；④凝胶层析：某些凝胶对于分子大小不同的组分，阻滞作用有所差异，从而进行分离；⑤亲和层析：利用生物分子的生物学特性不同来分离蛋白质；⑥疏水相互作用层析：利用不同蛋白疏水区的不同性质分离蛋白；⑦共价层析：利用亲和支持物和靶分子之间形成的牢固但