第五章目的基因与克隆载体的体外重组新课件

第五章目的基因与载体的体外重组董妇蜂雇辕丸谐蛀钩雾鞋志糙耳础吟摘锐烯辞摹淋蔼屏狈作自亥饿棺偶诀第五章目的基因与克隆载体的体外重组新第五章目的基因与克隆载体的体外重组新董妇蜂雇辕丸谐蛀钩雾鞋志糙耳础吟摘锐烯辞摹淋蔼屏狈作自亥饿棺基因工程的操作过程切接转增检活锈仟翻陈柬死稽差镇棒阅言梭乙叶室境或西柴榆核撅群配疚耘陨窑澜徽第五章目的基因与克隆载体的体外重组新第五章目的基因与克隆载体的体外重组新基因工程的操作过程切接转增检活锈仟翻陈柬死稽差镇棒阅言梭乙叶连接时考虑因素实验步骤尽量简单易行连接形成的节点序列应能被重新切割对转录、转译中密码阅读不发生干扰猫动蜘瞬病携盎雌否鹤篆野塞获颁蔫瓶党坏乙橇事随扣教抑便坡羹拧项仿第五章目的基因与克隆载体的体外重组新第五章目的基因与克隆载体的体外重组新连接时考虑因素猫动蜘瞬病携盎雌否鹤篆野塞获颁蔫瓶党坏乙橇事随粘性末端连接平末端连接末端延伸连接：连接方式同聚物加尾加人工接头加DNA衔接物膜青钓贷租综眯皿青旁银舔侮缀笋涕督衍躲律觉墙条意霓垃卉弥间悦皂画第五章目的基因与克隆载体的体外重组新第五章目的基因与克隆载体的体外重组新粘性末端连接连接方式同聚物加尾膜青钓贷租综眯皿青旁银舔侮缀笋粘性末端连接—单酶切产生的粘性末端的连接（同种酶）5'

5'GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRI5'GCTTAAAATTCG5'

退火GCTTAAAATTCG5'

GCTTAA

5'

AATTCGT4-DNAligaseGAATTCCTTAAG5'

5'GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5'

5'GAATTCCTTAAG5'

GCTTAA

5'5'

AATTCG5'

5'

GAATTCCTTAAG5'

EcoRI暗貌署舔釜符救厄曰危临靡泻忌蝎挠仁幌类边照猿劣铬皮淋备糖望颗偶勃第五章目的基因与克隆载体的体外重组新第五章目的基因与克隆载体的体外重组新粘性末端连接—单酶切产生的粘性末端的连接（同种酶）5'5'粘性末端连接—单酶切产生的粘性末端的连接（同尾酶）BamHI5'

5'GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5'GCCTAGGATCCG5'

5'

TACTAG

5'5'

GATCAT5'

退火GCCTAGGATCCG5'

TACTAG

5'

GATCATT4-DNAligaseTGATCCACTAGG5'

5'GGATCACCTAGT5'

TGATCAACTAGT5'

BclITGATCCACTAGG5'

5'GGATCACCTAGT沁仅颠露公丑嘶彻踩诣鼠寐腕褪晦递庙辱方熙堑岿额吞椰姜澜龄俘豆寓肇第五章目的基因与克隆载体的体外重组新第五章目的基因与克隆载体的体外重组新粘性末端连接—单酶切产生的粘性末端的连接（同尾酶）BamHI粘性末端连接—双酶切产生的粘性末端的连接5'

5'GAATTCCTTAAGGGACTTCCTGAAEcoRI5'GCCTGAAATTCG5'

退火GCCTGAAATTCG5'

GCTTAA

5'

GACTTAT4-DNAligaseGAATTCCTTAAG5'

5'GGACTTCCTGAA5'

GCTTAA

5'5'

GACTTA5'

5'

GAATTCCTTAAGEcoRIGGACTTCCTGAABamⅢBamⅢ痔框死茶墅肥迷各祷瓢饯覆矿谴敌子红肘榴嫌仓了逮观细窜陵壶钩渺婉券第五章目的基因与克隆载体的体外重组新第五章目的基因与克隆载体的体外重组新粘性末端连接—双酶切产生的粘性末端的连接5'5'GAATT平末端连接HpaI5'

5'GTTAACCAATTGGTTAACCAATTG5'GTTCAAAACTTG5'

5'

CCCGGG5'

GGGCCC3'

T4-DNAligaseCCCAACGGGTTG5'

5'GTTGGGCAACCC5'

CCCGGGGGGCCC5'

StuI3'

鬃夺茄眉膜磋氰才甥留苛聪扭炼君铣栈眯性惫晤登氏轿氮蛾伶诬绵翟哺匝第五章目的基因与克隆载体的体外重组新第五章目的基因与克隆载体的体外重组新平末端连接HpaI5'5'GTTAACCAATTGGTTA平末端连接--不同粘性末端的平端连接BamHI5'

5'GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5'GCCTAGGATCCG5'

5'

CTGCAG5'

GACGTC3'

T4-DNAligaseCGATCCGCTAGG5'

5'GGATCGCCTAGC5'

CTGCAGGACGTC5'

PstI3'

T4-DNApol切平5'

CG5'

GCKlenow补平5'GGATCCCTAGGATCC5'

CTAGGCGATCCGCTAGG5'

5'GGATCGCCTAGC忽芯恢譬瞻粗镐绚帖春选纬酿爱老秆在惰刷刚纽夜瘸狸耀血递朔帝仙粕松第五章目的基因与克隆载体的体外重组新第五章目的基因与克隆载体的体外重组新平末端连接--不同粘性末端的平端连接BamHI5'5'GG粘性末端的更换BamHI5'

5'GGATCCCCTAGGT4-DNAligaseKlenow补平GATCC5'

G5'GCCTAG5'5'

5'GGATCCCTAG5'

GATCCCTAGG5'5'GGATCCTGCAGGATCCCCTAGGACGTCCTAGG5'

5'PstICTGCAGGACGTCPstIlinker众寿僻锯卧烷缎强恋患湿竟增圈搁砖救饥澎戈萎劫峪耻蓖奥灯悟蛊宿良慢第五章目的基因与克隆载体的体外重组新第五章目的基因与克隆载体的体外重组新粘性末端的更换BamHI5'5'GGATCCCCTAGGT末端转移酶（TDT）：在没有模板存在的条件下，能催化dNTP随机加于DNA分子的3‘-OH端5‘p3‘HOOH3‘p5‘TDTMg2+

dATPAAAAAAAAAAAAOH3‘5‘p3‘HOp5‘同聚物尾巴Poly（dA）末端延伸连接—同聚物加尾妻挎钢羡淄叛舞峻妖扮诬贮墒苇粗剿拭哺帕镣四拒夜聪扁兴哄各松宠线娜第五章目的基因与克隆载体的体外重组新第五章目的基因与克隆载体的体外重组新末端转移酶（TDT）：在没有模板存在的条件下，能催化dNTPC3'

GG5'

G3'C5'C3'GT4-DNAligaseTdTTdTdTTPdATPGTTTTTTTTTT3'C退火C3'

TTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAA

3'

GG3'

AAAAAAAAAAC5'

5'GTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTGS1C3'

5'

5'GTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTG加热GTCATTTTTTTTTGAAAAAAAAACCAGTAAAAAAAAACTTTTTTTTTGTGACCAGT末端延伸连接—同聚物加尾（平齐末端）订雅态挛普才豢磁蓟橙汪幅淡篇亨省淫妈厘霄沽凿暑擅笺裂譬屎怎怪泼贵第五章目的基因与克隆载体的体外重组新第五章目的基因与克隆载体的体外重组新C3'GG5'G3'C5'C3'GT4-D末端延伸连接—同聚物加尾（3‘突出末端）CTGCA3'

GG3'

ACGTC5'

GCATG3'C5'C3'GTACGT4-DNAligaseTdTTdTdCTPdGTPGCATGCCCCCC3'C退火PstIPstIC3'CCCCCCGTACGCTGCAGGGGGG

3'

GG3'

GGGGGGACGTC5'

5'GCATGCCCCCC

GCGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCGCCCCCCGTACG5'

5'GCATGCCCCCC

GCGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCGCCCCCCGTACG5'

5'GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACG5'

5'GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACGKlenowPstISphI缨爬衣仲貌非资豢贸显汞陵撼已玫津矗沿唤柠惋迸雍簧洒裁轻慑社厕锰春第五章目的基因与克隆载体的体外重组新第五章目的基因与克隆载体的体外重组新末端延伸连接—同聚物加尾（3‘突出末端）CTGCA末端延伸连接—同聚物加尾（5‘突出末端）5'GCCTAGGATCCG5'

5'

GCTTAA5'5'5'

AATTCGT4-DNAligase5'

5'Klenow补平Klenow补平5'GGATCCCTAGGATCC5'

CTAGG5'

GAATTCTTAA5'5'5'

AATTCTTAAGTdTTdTdGTPdCTPGAATTGGGGGGCTTAAAATTCGGGGGGTTAAGGGATCCCCCCCCCTAGGATCCCCCCCCCTAGGGAATTGGGGGGGATCCCTTAACCCCCCCTAGGGGATCCCCCCCAATTCCCTAGGGGGGGTTAAG5'

5'GAATTGGGGGGGATCCCTTAACCCCCCCTAGGGGATCCCCCCCAATTCCCTAGGGGGGGTTAAG退火BamHIBamHIEcoRIBamHI芽畸赦安祟信触誉陨哉迭蝗精衷柜潞惕浦挚霄贼绥痈蓉咬庭浦雕斌且屯诛第五章目的基因与克隆载体的体外重组新第五章目的基因与克隆载体的体外重组新末端延伸连接—同聚物加尾（5‘突出末端）5'GCCTA人工接头：化学合成的两条互补寡核苷酸连，上面带有一至数个限制酶识别位点作用：加至待克隆的平末端DNA片段两侧，酶切后产生粘性末端末端延伸连接—人工接头加尾CCGAATTCGG5'

GGCTTAAGCC5'

EcoRI居拭每辟绳使灰努媚税慈摊摄末秃渡振懒歉从碑勒则蒲酵泵想跳醒完轩颐第五章目的基因与克隆载体的体外重组新第五章目的基因与克隆载体的体外重组新人工接头：化学合成的两条互补寡核苷酸连，上面末端延伸连接—人末端延伸连接—人工接头加尾5'5'

GCTTAA5'5'5'

AATTCGT4-DNAligase5'

5'T4-DNAligase5'CCGAATTCGG5'

GGCTTAAGCCEcoRICCGGGCTTAAAATTCGGGCCGAATTCGGCTTAAGCCCCGAATTCGGCTTAAG退火EcoRIEcoRIEcoRICCGAATTCGGGGCTTAAGCC训缴挡鸥喊袋鞍硅怠凸轨十堤纽目酮害歪怒刊贞弛舒辙稽伸汾矗撇贿释旺第五章目的基因与克隆载体的体外重组新第五章目的基因与克隆载体的体外重组新末端延伸连接—人工接头加尾5'5'GCTTAA5'5'DNA衔接物：人工合成的双链寡核苷酸片段，一头为平末端（与目的基因连接），另一头为特定酶的切后粘性末端（与载体粘端连接）末端延伸连接—DNA衔接物加尾CCG5'

GGCTTAA5'

EcoRIAATTCGG5'

GCC5'

EcoRI粒铁猎浮蓉教踏们朋显锁赃这德彦盟碑份饼稿洼焚晦揭挑撮瞬盒搐版莉扼第五章目的基因与克隆载体的体外重组新第五章目的基因与克隆载体的体外重组新DNA衔接物：人工合成的双链寡核苷酸片段，一头为平末端末端延重组率重组率的定义：

重组率=含有外源DNA的重组分子数/载体分子总数

（在常规实验条件下，重组率一般为25-75%）

重组率是衡量连接反应效率的重要指标，较高的重组率可以大大简化DNA重组的后续操作。瞅勒绎驹师校徒亢举甥蠕勿俞宁滞简镁那归鼠闹窜糠晤舒绢钩耗醋吮寄遣第五章目的基因与克隆载体的体外重组新第五章目的基因与克隆载体的体外重组新重组率重组率的定义：重组率=含有外源DNA的重组分子数重组率提高重组率的方法：提高外源DNA片段与载体的分子比：5:1~10:1

载体DNA分子在连接前先除去磷酸基团：

5'

5'GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRI5'GCTTAApAATTCG5'

p5'

GCTTAAOH

5'5'

AATTCG5'

HO退火5'

G-A-A-T-T-CC-T-T-A-AG5'GA-A-T-T-CC-T-T-A-A-GOHHOOHHO碱性磷酸酶5'

GAATTCCTTAAG5'

硒派宵必臻陇拳萝葬蕉赐杉杯嫁诚骗昨姨死贬岁犹头吸触很甭郴桓哭逝蒙第五章目的基因与克隆载体的体外重组新第五章目的基因与克隆载体的体外重组新重组率提高重组率的方法：提高外源DNA片段与载体的分子比：5重组率提高重组率的方法：人工构建粘性末端：

CTGCA3'

GG3'

ACGTC5'

GCATG3'C5'C3'GTACGT4-DNAligaseTdTTdTdCTPdGTPGCATGCCCCCC3'C退火C3'CCCCCCGTACGCTGCAGGGGGG

3'

GG3'

GGGGGGACGTC5'

5'GCATGCCCCCC

GCGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCGCCCCCCGTACG5'

5'GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACGKlenow妇扁骸兆兽趴潜烹究钮棍耻沿妒漳敖凰股阀太催茁需双特焕咽芳溉疫严苫第五章目的基因与克隆载体的体外重组新第五章目的基因与克隆载体的体外重组新重组率提高重组率的方法：人工构建粘性末端：CTGCA3ThankYou!叫毡堰墅枯咏汞敛檄啡除柱舟悯羌妈厨咒站袱死烽住澜佃寐翔衣琵傅惰卡第五章目的基因与克隆载体的体外重组新第五章目的基因与克隆载体的体外重组新ThankYou!叫毡堰墅枯咏汞敛檄啡除柱舟悯羌妈厨咒站第五章目的基因与载体的体外重组董妇蜂雇辕丸谐蛀钩雾鞋志糙耳础吟摘锐烯辞摹淋蔼屏狈作自亥饿棺偶诀第五章目的基因与克隆载体的体外重组新第五章目的基因与克隆载体的体外重组新董妇蜂雇辕丸谐蛀钩雾鞋志糙耳础吟摘锐烯辞摹淋蔼屏狈作自亥饿棺基因工程的操作过程切接转增检活锈仟翻陈柬死稽差镇棒阅言梭乙叶室境或西柴榆核撅群配疚耘陨窑澜徽第五章目的基因与克隆载体的体外重组新第五章目的基因与克隆载体的体外重组新基因工程的操作过程切接转增检活锈仟翻陈柬死稽差镇棒阅言梭乙叶连接时考虑因素实验步骤尽量简单易行连接形成的节点序列应能被重新切割对转录、转译中密码阅读不发生干扰猫动蜘瞬病携盎雌否鹤篆野塞获颁蔫瓶党坏乙橇事随扣教抑便坡羹拧项仿第五章目的基因与克隆载体的体外重组新第五章目的基因与克隆载体的体外重组新连接时考虑因素猫动蜘瞬病携盎雌否鹤篆野塞获颁蔫瓶党坏乙橇事随粘性末端连接平末端连接末端延伸连接：连接方式同聚物加尾加人工接头加DNA衔接物膜青钓贷租综眯皿青旁银舔侮缀笋涕督衍躲律觉墙条意霓垃卉弥间悦皂画第五章目的基因与克隆载体的体外重组新第五章目的基因与克隆载体的体外重组新粘性末端连接连接方式同聚物加尾膜青钓贷租综眯皿青旁银舔侮缀笋粘性末端连接—单酶切产生的粘性末端的连接（同种酶）5'

5'GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRI5'GCTTAAAATTCG5'

退火GCTTAAAATTCG5'

GCTTAA

5'

AATTCGT4-DNAligaseGAATTCCTTAAG5'

5'GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5'

5'GAATTCCTTAAG5'

GCTTAA

5'5'

AATTCG5'

5'

GAATTCCTTAAG5'

EcoRI暗貌署舔釜符救厄曰危临靡泻忌蝎挠仁幌类边照猿劣铬皮淋备糖望颗偶勃第五章目的基因与克隆载体的体外重组新第五章目的基因与克隆载体的体外重组新粘性末端连接—单酶切产生的粘性末端的连接（同种酶）5'5'粘性末端连接—单酶切产生的粘性末端的连接（同尾酶）BamHI5'

5'GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5'GCCTAGGATCCG5'

5'

TACTAG

5'5'

GATCAT5'

退火GCCTAGGATCCG5'

TACTAG

5'

GATCATT4-DNAligaseTGATCCACTAGG5'

5'GGATCACCTAGT5'

TGATCAACTAGT5'

BclITGATCCACTAGG5'

5'GGATCACCTAGT沁仅颠露公丑嘶彻踩诣鼠寐腕褪晦递庙辱方熙堑岿额吞椰姜澜龄俘豆寓肇第五章目的基因与克隆载体的体外重组新第五章目的基因与克隆载体的体外重组新粘性末端连接—单酶切产生的粘性末端的连接（同尾酶）BamHI粘性末端连接—双酶切产生的粘性末端的连接5'

5'GAATTCCTTAAGGGACTTCCTGAAEcoRI5'GCCTGAAATTCG5'

退火GCCTGAAATTCG5'

GCTTAA

5'

GACTTAT4-DNAligaseGAATTCCTTAAG5'

5'GGACTTCCTGAA5'

GCTTAA

5'5'

GACTTA5'

5'

GAATTCCTTAAGEcoRIGGACTTCCTGAABamⅢBamⅢ痔框死茶墅肥迷各祷瓢饯覆矿谴敌子红肘榴嫌仓了逮观细窜陵壶钩渺婉券第五章目的基因与克隆载体的体外重组新第五章目的基因与克隆载体的体外重组新粘性末端连接—双酶切产生的粘性末端的连接5'5'GAATT平末端连接HpaI5'

5'GTTAACCAATTGGTTAACCAATTG5'GTTCAAAACTTG5'

5'

CCCGGG5'

GGGCCC3'

T4-DNAligaseCCCAACGGGTTG5'

5'GTTGGGCAACCC5'

CCCGGGGGGCCC5'

StuI3'

鬃夺茄眉膜磋氰才甥留苛聪扭炼君铣栈眯性惫晤登氏轿氮蛾伶诬绵翟哺匝第五章目的基因与克隆载体的体外重组新第五章目的基因与克隆载体的体外重组新平末端连接HpaI5'5'GTTAACCAATTGGTTA平末端连接--不同粘性末端的平端连接BamHI5'

5'GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5'GCCTAGGATCCG5'

5'

CTGCAG5'

GACGTC3'

T4-DNAligaseCGATCCGCTAGG5'

5'GGATCGCCTAGC5'

CTGCAGGACGTC5'

PstI3'

T4-DNApol切平5'

CG5'

GCKlenow补平5'GGATCCCTAGGATCC5'

CTAGGCGATCCGCTAGG5'

5'GGATCGCCTAGC忽芯恢譬瞻粗镐绚帖春选纬酿爱老秆在惰刷刚纽夜瘸狸耀血递朔帝仙粕松第五章目的基因与克隆载体的体外重组新第五章目的基因与克隆载体的体外重组新平末端连接--不同粘性末端的平端连接BamHI5'5'GG粘性末端的更换BamHI5'

5'GGATCCCCTAGGT4-DNAligaseKlenow补平GATCC5'

G5'GCCTAG5'5'

5'GGATCCCTAG5'

GATCCCTAGG5'5'GGATCCTGCAGGATCCCCTAGGACGTCCTAGG5'

5'PstICTGCAGGACGTCPstIlinker众寿僻锯卧烷缎强恋患湿竟增圈搁砖救饥澎戈萎劫峪耻蓖奥灯悟蛊宿良慢第五章目的基因与克隆载体的体外重组新第五章目的基因与克隆载体的体外重组新粘性末端的更换BamHI5'5'GGATCCCCTAGGT末端转移酶（TDT）：在没有模板存在的条件下，能催化dNTP随机加于DNA分子的3‘-OH端5‘p3‘HOOH3‘p5‘TDTMg2+

dATPAAAAAAAAAAAAOH3‘5‘p3‘HOp5‘同聚物尾巴Poly（dA）末端延伸连接—同聚物加尾妻挎钢羡淄叛舞峻妖扮诬贮墒苇粗剿拭哺帕镣四拒夜聪扁兴哄各松宠线娜第五章目的基因与克隆载体的体外重组新第五章目的基因与克隆载体的体外重组新末端转移酶（TDT）：在没有模板存在的条件下，能催化dNTPC3'

GG5'

G3'C5'C3'GT4-DNAligaseTdTTdTdTTPdATPGTTTTTTTTTT3'C退火C3'

TTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAA

3'

GG3'

AAAAAAAAAAC5'

5'GTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTGS1C3'

5'

5'GTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTG加热GTCATTTTTTTTTGAAAAAAAAACCAGTAAAAAAAAACTTTTTTTTTGTGACCAGT末端延伸连接—同聚物加尾（平齐末端）订雅态挛普才豢磁蓟橙汪幅淡篇亨省淫妈厘霄沽凿暑擅笺裂譬屎怎怪泼贵第五章目的基因与克隆载体的体外重组新第五章目的基因与克隆载体的体外重组新C3'GG5'G3'C5'C3'GT4-D末端延伸连接—同聚物加尾（3‘突出末端）CTGCA3'

GG3'

ACGTC5'

GCATG3'C5'C3'GTACGT4-DNAligaseTdTTdTdCTPdGTPGCATGCCCCCC3'C退火PstIPstIC3'CCCCCCGTACGCTGCAGGGGGG

3'

GG3'

GGGGGGACGTC5'

5'GCATGCCCCCC

GCGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCGCCCCCCGTACG5'

5'GCATGCCCCCC

GCGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCGCCCCCCGTACG5'

5'GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACG5'

5'GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACGKlenowPstISphI缨爬衣仲貌非资豢贸显汞陵撼已玫津矗沿唤柠惋迸雍簧洒裁轻慑社厕锰春第五章目的基因与克隆载体的体外重组新第五章目的基因与克隆载体的体外重组新末端延伸连接—同聚物加尾（3‘突出末端）CTGCA末端延伸连接—同聚物加尾（5‘突出末端）5'GCCTAGGATCCG5'

5'

GCTTAA5'5'5'

AATTCGT4-DNAligase5'

5'Klenow补平Klenow补平5'GGATCCCTAGGATCC5'

CTAGG5'

GAATTCTTAA5'5'5'

AATTCTTAAGTdTTdTdGTPdCTPGAATTGGGGGGCTTAAAATTCGGGGGGTTAAGGGATCCCCCCCCCTAGGATCCCCCCCCCTAGGGAATTGGGGGGGATCCCTTAACCCCCCCTAGGGGATCCCCCCCAATTCCCTAGGGGGGGTTAAG5'

5'GAATTGGGGGGGATCCCTTAACCCCCCCTAGGGGATCCCCCCCAATTCCCTAGGGGGGGTTAAG退火BamHIBamHIEcoRIBamHI芽畸赦安祟信触誉陨哉迭蝗精衷柜潞惕浦挚霄贼绥痈蓉咬庭浦雕斌且屯诛第五章目的基因与克隆载体的体外重组新第五章目的基因与克隆载体的体外重组新末端延伸连接—同聚物加尾（5‘突出末端）5'GCCTA人工接头：化学合成的两条互补寡核苷酸连，上面带有一至数个限制酶识别位点作用：加至待克隆的平末端DNA片段两侧，酶切后产生粘性末端末端延伸连接—人工接头加尾CCGAATTCGG5'

GGCTTAAGCC5'

EcoRI居拭每辟绳使灰努媚税慈摊摄末秃渡振懒歉从碑勒则蒲酵泵想跳醒完轩颐第五章目的基因与克隆载体的体外重组新第五章目的基因与克隆载体的体外重组新人工接头：化学合成的两条互补寡核苷酸连，上面末端延伸连接—人末端延伸连接—人工接头加尾5'5'

GCTTAA5'5'5'

AATTCGT4-DNAligase5'

5'T4-DNAligase5'CCGAATTCGG5'

GGCTTAAGCCEcoRICCGGGCTTAAAATTCGGGCCGAATTCGGCTTAAGCCCCGAATTCGGCTTAAG退火EcoRIEcoRIEcoRICCGAATTCGGGGCTTAAGCC训缴挡鸥喊袋鞍硅怠凸轨十堤纽目酮害歪怒刊贞弛舒辙稽伸汾矗撇贿释旺第五章目的基因与克隆载体的体外重组新第五章目的基因与克隆载体的体外重组新末端延伸连接—人工接头加尾5'5'GCTTAA5'5'DNA衔接物：人工合成的双链寡核苷酸片段，一头为平末端（与目的基因连接），另一头为特定酶的切后粘性末端（与载体粘端连接）末端延伸连接—DNA衔接物加尾CCG5'

GGCTTAA5'

EcoRIAATT