TQ0701对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用

PAGE毕业论文论文题目TQ0701对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用英文题目ProtectiveeffectsofTQ0701oncerebralischemicreperfusioninjuryinrats目录TOC\o"1-2"\h\z\u摘要 1前言 3第一章材料 61.1药物和试剂 61.2主要仪器 71.3动物 7第二章方法 82.1TQ0701iv对局灶性脑缺血大鼠的神经功能和脑组织梗塞率的影响 82.2TQ0701iv对局灶性脑缺血大鼠脑组织学的影响 92.3统计学处理 9第三章结果 103.1TQ0701对局灶性脑缺血大鼠的神经功能和脑组织梗塞率的影响 103.2TQ0701对局灶性脑缺血大鼠脑组织学的影响 10第四章讨论 12参考文献 14致谢 16TQ0701对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用摘要：目的:探讨新型的化合物TQ0701对大鼠脑缺血再灌注损伤保护作用的有效性，从而为该化合物的机制研究以及临床应用开发提供相关实验数据和实验思路。方法:将60只雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、阳性对照组（依达拉奉3mg/kg）、TQ0701低剂量组(1.5mg/kg)、中剂量组(3mg/kg)、高剂量组(6mg/kg)各10只。假手术组仅进行手术而不造成缺血状态，其余各组均采用Longa线栓法制备大鼠MCAO模型，在缺血2h后进行再灌注。给药组和阳性对照组分别在缺血前30min以及再灌注0、2h尾静脉注射TQ0701和依达拉奉，假手术组和模型组则给予等量的0.9%氯化钠溶液。再灌注24h后观察大鼠神经功能评分、脑组织梗塞百分率和病理组织学的改变。结果:模型组大鼠的神经功能评分和脑组织梗塞百分率同假手术组、阳性对照组以及TQ0701三个剂量组相比有显著差异，阳性对照组与TQ0701三个剂量组相比未见显著差异。同时电镜观察结果也发现TQ0701三个剂量组及阳性对照组与模型组相比神经细胞病理改变较轻。结论：化合物TQ0701对急性脑梗死有明显的保护作用。关键词：TQ0701；脑缺血再灌注；依达拉奉；Abstract:Aim:ToinvestigatetheeffectsofTQ0701bydynamicchangesofinfarctvolumesandneurologicaldeficitscoresonlocalcerebralischemic-reperfusioninjuryinrats.Method:MaleSDratswererandomlydividedintosham-operatedcontrolgroup(n=10),normalsalinecontrolgroups(n=10),edaravone-treatedgroup(3mg/kg)(n=10)andTXL-treatedgroups(6mg/kg,3mg/kgand1.5mg/kg)(n=10each).Animalsinthelatterfourgroupsweresubjectedtotransientfocalischemiabythemiddlecerebralarteryocclusion(MCAO)for120minutes.TheratswerepretreatedwithnormalsalineorTXL30minbeforeischemicand0min,2hoursafterreperfusion.After24hoursofreperfusion,infarctvolumesweredeterminedby2,3,5-triphenyltetrazoliumchloride(TTC)andneurologicalscoreswereinvestigated.Results:InfarctvolumesinTQ0701-treatedgroupsweresignificantlydecreasedcomparedwiththoseincontrolgroupsat24afterMCAO,andtheneurologicaldeficitscoresinTQ0701-treatedgroupsweresynchronouslyimproved.Conclusion:TheseresultsshowthattreatmentwithTQ0701canattenuatebraininjuryandTQ0701maybeapotentialneuroprotectiveagentincerebralischemia-reperfusion.Keywords:TQ0701;cerebralischemicreperfusion;edaravone前言目前，脑血管病严重危害人类健康，已成为三大死亡原因之一，其中缺血性脑血管病约占56.6%～80%。因此对于脑血管病治疗药物的研究与开发具有很大的实际价值和前景。随着对急性脑缺血再灌注和缺氧复氧损伤研究的进展，对脑梗塞的病理生理机制有了新的认识。大量研究已经证实了急性缺血后恢复血液灌流，会使病变加剧而发生再灌注损伤。目前主要从细胞内钙离子、NMDA受体、自由基、花生四烯酸代谢、缺血区酸碱平衡破坏、基因表达及蛋白质的磷酸化等方面，对脑缺血再灌注损伤的机理和防治开展了广泛而深人的研究。下面就几个最基础的病理生理机制进行探讨。1.钙与缺血缺氧性脑损伤细胞内钙作为第二信使、代谢调节因子和膜稳定剂在细胞正常机能活动中起重要作用，亦可介导多种病理情况下的细胞死亡。生理情况下，钙在细胞内外存在很大的浓度差，这依赖于膜正常通透性及胞浆钙外排机制来维持，后一过程需消耗能量。脑缺血缺氧时主要由于ATP供应不足、N-甲基-D-门冬氨酸(NMDA)受体过度兴奋介导与其偶联的钙通道开放、膜通透性增大及封阻机制障碍而致细胞外钙内流增加、胞浆钙外排障碍，造成细胞内Ca2+浓度增高[1]。细胞内Ca2+超载，一方面使血管收缩、进一步加重脑缺血缺氧；同时引起细胞代谢、结构与功能多方面的异常改变，从而导致细胞死亡。2.自由基连锁反应脑缺血再灌注时，可通过黄嘌呤氧化酶、线粒体系统、白细胞系统、花生四烯酸相关酶系统、一氧化氮合成酶(NOS)系统等使自由基大量产生，同时自由基防御系统功能受损，动态平衡被打乱。自由基具有很高的化学活性，可快速攻击其它化合物的分子并产生更多的自由基，自由基破坏膜结构中蛋白成分、引起膜脂质过氧化，导致膜损伤、线粒体功能障碍、溶酶体破裂、细胞溶解和组织水肿等一系列损害作用，称之为自由基连锁反应[2-4]。近年大量研究证实，氧自由基介导的自由基连锁反应是导致脑缺血缺氧与再灌注复氧损伤的主要原因。3.兴奋性氨基酸的神经毒性作用生理情况下，兴奋性氨基酸作为正常的神经递质，在神经元之间的信息传递中发挥重要作用。突触前膜释放的谷氨酸（GIU）主要通过神经细胞膜上的高亲和性摄取系统摄取灭活，细胞外液GIU浓度维持在1umol/L左右。病理状态下，GIU通过使神经元过度兴奋而发挥其神经毒作用。在脑缺血缺氧时，GIU大量释放，同时其再摄取机制受阻，在突触中堆集，使NMDA受体过度兴奋，启动NMDA受体的控钙通道而使外钙大量内流，由此引发神经细胞的损伤。目前认为，细胞内钙超载是介导兴奋性氨基酸递质神经毒性作用的关键因素。GIU主要与局灶性或不完全性脑缺血性损伤有关[5]。4.脑内NO的神经细胞毒性作用NO在脑缺血损伤中的作用可能是双重性的。它一方面可通过舒张脑血管和抑制血小板聚集，下调NMDA受体，从而改善组织灌流、对缺血边缘区脑组织施加直接保护作用，减轻缺血性损害；另一方面可通过形成自由基或其它途径，而产生神经毒性，加重缺血损伤，促使缺血区边缘脑组织向梗死发展。5.花生四烯酸代谢失衡脑缺血再灌注时，通过AA代谢产生大量的TXA2、PGF2及白三烯(LT)C4、B4等物质。同时，由于合成酶抑制或内皮细胞损伤而致与TXA2、PGF2具有对抗作用的PGI2产生减少，造成TXA2/PGI2比值失衡。TXA2、PGF2和白三烯等可致血小板聚积、脑血管痉挛和血管通透性增加，加重脑缺血和脑水肿形成，导致缺血后迟发性低灌注损伤[6]：LTB4和12-羟花生四烯酸对白细胞浸润和激活起着放大作用。并且，AA自身代谢过程中，可产生大量O2-，从不同途径导致组织损伤。可见，AA代谢失衡在脑缺血再灌注损伤中起着非常重要的作用。依达拉奉首先由日本三菱东京制药株式会社开发，2001年6月刚刚在日本上市。1984年日本三菱东京制药株式会社根据酚类化合物具有强的自由基清除作用的原理,经过多次筛选,终于研发出一种神经元保护剂(自由基清除剂)依达拉奉。它是一种安替吡啉的代谢产物，其在体内以阴离子形式存在，血脑屏障通透性高，静脉给药可清除大脑内具有高度细胞毒性的羟自由基。因此，该药最早用于脑缺血性病变急性期治疗。研究表明，作为自由基清除剂，依达拉奉可有效改善脑组织缺血再灌注损伤。脑缺血再灌注后，过多的氧自由基导致脑组织直接损伤及细胞膜脂质过氧化，破坏细胞膜结构和完整性，引起细胞膜通透性增加，细胞毒性水肿增加。研究证实，依达拉奉能减少神经元NO合成酶，增加内皮型NO合酶，抑制脑线粒体通透性转运孔开放，起到脑组织保护作用。另外，依达拉奉还能明显抑制缺血区脑水肿，减少缺血再灌注引起的白三烯合成[7]。可见，依达拉奉能对缺血再灌注损伤的脑组织起到理想的保护作用。随着该药的脑保护作用逐渐得到临床肯定，其适应症进一步扩大，如治疗心肌缺血、肺缺血、肾脏缺血、肝脏缺血和肠缺血等，其相关研究已取得较大进展。鉴于依达拉奉良好的脑保护作用，在依达拉奉的基础上，对其进行结构改造，合成了新型化合物TQ0701。本课题就是主要观察TQ0701对于脑缺血的保护作用，从而为该化合物的机制研究以及临床应用开发提供相关实验数据和实验思路。第一章材料1.1药物和试剂1.1.1TQ0701原料：提供单位：江苏正大天晴制药有限公司规格：纯度为98.0％以上配制方法：按(1.2mgTQ0701原料)：(1mL0.9%氯化钠溶液)的比例配制成原液。TQ0701高剂量组，给予大鼠iv0.5mL/100g体重的原液；中剂量组需将原液用0.9%氯化钠溶液稀释一倍，给药体积同上；低剂量组将原液稀释两倍，给药体积同上1.1.2依达拉奉(Edaravone)原料：提供单位：江苏正大天晴制药有限公司规格：纯度为98.0％以上配制方法：按(0.6mg依达拉奉原料)：(1mL0.9%氯化钠溶液)的比例配制成溶液。大鼠iv0.5mL/100g体重1.1.3水合氯醛(TCA):提供单位：国药集团化学试剂有限公司规格：分析纯配制方法：用0.9%氯化钠溶液配制成10%的溶液，大鼠ip0.5mL/100g体重1.1.4红四氮唑(TTC)：提供单位：上海灵锦精细化工有限公司规格：分析纯配制方法：用PBS溶液配制成1%的溶液，4℃避光1.1.5配制方法：每升蒸馏水加入NaCl8.00g，KCL0.20g，Na2HPO4·H2O0.156g，KH2PO40.20g，充分溶解%氯化钠溶液：提供单位：中国大冢制药有限公司规格：250ml/瓶1.1.7提供单位：常州千红生化制药有限公司规格：2mL:12500单位配制方法：临用前加0.9%氯化钠溶液将肝素配制成125μ/mL溶液1.1.8无水乙醇：提供单位：无锡市亚盛化工有限公司规格：分析纯配制方法：用蒸馏水配制成75%的溶液1.1.9甲醛提供单位：国药集团化学试剂有限公司规格：分析纯配制方法：用蒸馏水配制成10%的溶液，避光保存1.1.10HE染色提供单位：南京建成生物工程研究所1.2主要仪器1.2.1电热恒温水浴锅：江苏省东台市电器厂1.2.2分析天平：北京赛多利斯天平有限公司1.3动物SD大鼠，雄性，220～260g，清洁级，生产许可证由河南省实验动物中心提供，生产许可证号：SCXK(豫)2005-0001；使用许可证由中国药科大学新药筛选中心提供，使用许可证号：第二章方法2.1TQ0701iv对局灶性脑缺血大鼠的神经功能和脑组织梗塞率的影响取SD大鼠60只，雄性，体重220～260g，按体重随机分为6组，分别为假手术组，模型组（均给以等量0.9%氯化钠溶液），阳性对照组（依达拉奉3mg/kg），TQ0701高、中、低三个剂量组（6、3、1.5mg/kg）。以上各组给药容量均为0.5mL/100g。参考Longa[8～10]等人的方法，采用颈内动脉线栓法制备大鼠大脑中动脉闭塞（MCAO）模型。大鼠用10%水合氯醛（300mg/kg）ip麻醉后仰卧恒温手术台上。从颈部正中切口，暴露右侧颈总动脉，向外牵引二腹肌及胸锁乳突肌，由颈总动脉分叉处向头端依次游离，结扎并剪断颈外动脉的分支：枕骨下动脉和甲状腺上动脉，在颈外动脉远端结扎，切断颈外动脉使其主干游离备用，然后分离颈内动脉，用丝线在颈外动脉根部打一松扣，夹闭颈总动脉和颈内动脉。将尼龙线（长5cm，直径0.28mm）经颈外动脉主干切口，缓慢向颈内动脉入颅方向推进，以颈总动脉分叉处为标记，推进18mm左右时感到阻力，即达到了较细的大脑中动脉内，阻断了MCA的所有血供来源，扎紧颈外动脉根部松扣。2h后，拔出尼龙线，扎紧动脉残端。缝合皮肤，完成MCAO导致局灶性脑缺血—再灌注模型。假手术组大鼠麻醉后，仅暴露颈内外动脉分叉，不闭塞MCA。TQ0701三个剂量组和阳性对照组分别在缺血前30min以及再灌注0、2h尾静脉注射TQ0701和依达拉奉，假手术组和模型组则给予等量的0.9%氯化钠溶液。术后24h按Bederson的方法对动物的行为缺陷进行分级评分，标准如下[11]：0分：无神经功能缺失症状；1分：提大鼠尾，见瘫痪侧前肢回收屈曲不能正常伸向地面；2分：向瘫痪侧推时感阻力较对侧明显降低；3分：大鼠爬行时向瘫痪侧旋转；4分：伴有意识障碍。MCAO24h后，断头处死大鼠，取出全脑（去除小脑）。在视交叉及其前后各2mm处，做冠状切片5片，于1%TTC中避光37℃孵育30min，再分离苍白区（梗塞区）和非苍白区（正常区），计算梗塞百分比如下：梗塞百分比(%)=苍白区重量/(苍白区重量+非苍白区重量)×100%2.2TQ0701iv对局灶性脑缺血大鼠脑组织学的影响取SD大鼠60只，雌性，220～260g，随机分为6组，分组给药及手术方法如前。MCAO后24h断头处死大鼠，取出全脑（去除小脑），于10%甲醛溶液中固定。标本于腊制模具中切片后作HE染色，对大脑皮层海马进行病理组织学检查。2.3统计学处理实验数据用表示。采用单因素方差分析进行组间显著性比较,两组间样本均数比较采用t检验。第三章结果3.1TQ0701对局灶性脑缺血大鼠的神经功能和脑组织梗塞率的影响由表1可见：模型组的MCAO大鼠脑卒中评分明显增加，梗死面积也明显增大（P<0.01vs假手术组）。TQ0701给药组6、3、1.5mg/kgiv能显著降低MCAO大鼠的脑卒中评分，并能够明显减少局灶性脑缺血大鼠脑的梗死面积（P<0.01，P<0.05vs模型组）。三个剂量是随着浓度增大作用增强。依达拉奉3mg/kgiv也能显著改善MCAO大鼠的脑卒中评分，减少梗死面积（P<0.01vs模型组）。表1.TQ0701对局灶性脑缺血大鼠行为学评分、梗死面积的影响（，n=10）组别剂量（mg/kg）行为学评分梗死面积（％）假手术组－0.0±0.0△△－模型组－3.3±0.541.4±3.5阳性对照组31.7±0.8△△19.7±2.5△△TQ0701给药组61.5±0.6△△20.1±3.0△△31.9±0.7△△25.9±6.3△△1.52.6±0.7△36.0±5.6△△P<0.05,△△P<0.01vs模型组3.2TQ0701对局灶性脑缺血大鼠脑组织学的影响假手术组：10例脑组织神经元基本正常，核居中，未见神经元明显病变、坏死及炎细胞浸润等病理学改变。模型组：10例脑组织大脑皮质神经元均见中－重度变性、坏死（＋＋～＋＋＋），神经元结构模糊，胞体肿胀，尼氏小体减少或消失，出现不同程度的核深染、核固缩、核溶解，神经元数目明显减少，其中5例见筛状软化灶形成。阳性对照组：10例脑组织中有8例未见明显神经元变性、坏死及炎细胞浸润等病理学改变。2例脑组织神经元轻度变性、坏死（＋），神经元结构模糊，胞体肿胀，尼氏小体减少或消失，有不同程度的核深染、核固缩、核溶解。该组神经元数目较模型组多。TQ07016mg/kgiv组：10例脑组织中有7例脑组织未见神经元变性、坏死及炎细胞浸润等病理学改变。3例脑组织神经元见轻－中度变性、坏死（＋～＋＋），神经元结构模糊，胞体肿胀，尼氏小体减少或消失，出现不同程度的核深染、核固缩、核溶解。该组神经元数目较模型组多。TQ07013mg/kgiv组：10例脑组织中有6例脑组织未见神经元变性、坏死及炎细胞浸润等病理学改变。4例脑组织神经元见轻－中度变性、坏死（＋～＋＋），神经元结构模糊，胞体肿胀，尼氏小体减少或消失，出现不同程度的核深染、核固缩、核溶解。该组神经元数目较模型组多。TQ07011.5mg/kgiv组：10例脑组织中有4例脑组织未见神经元变性、坏死及炎细胞浸润等病理学改变。6例脑组织神经元见轻－中度变性、坏死（＋～＋＋），神经元结构模糊，胞体肿胀，尼氏小体减少或消失，出现不同程度的核深染、核固缩、核溶解，其中2例见筛状软化灶形成。与模型组相比，TQ0701对大鼠脑缺血所致神经元变性、坏死有一定的治疗作用。TQ0701三个剂量组中，大脑皮质锥体细胞和脑实质神经细胞的核固缩、核溶解程度比模型组明显减轻，软化灶减少，其中高、中剂量效果比较显著，而低剂量组的效果相对不明显。依达拉奉3mg/kgiv也对脑缺血造成的脑组织损伤有明显保护作用。第四章讨论机体组织器官正常代谢、功能的维持，有赖于良好的血液循环，各种原因造成的局部组织器官缺血可使组织细胞发生缺血性损伤。缺血性脑血管病又称脑梗死，指脑的主要供血动脉发生狭窄或闭塞，引起相应部位脑组织的缺血或坏死，其发病率、死亡率、复发率、致残率均非常高，且并发症多[12]。近年来，人们对脑缺血的病理生理提出了多种学说，为解释脑缺血机制奠定了基础。缺血后，在一定条件下恢复血液再灌注后，部分细胞功能代谢障碍及结构破坏不仅未减轻反而更加严重，这种现象称为缺血再灌注损伤。目前，缺血再灌注损伤的发生机制尚未充分阐明，大量实验研究证实，其主要与自由基损伤、高能磷酸化合物缺乏、细胞内钙超载等有关。自由基损伤是其主要损伤途径之一。脑缺血再灌注后出现一系列的病理生理改变包括能量耗竭、细胞内酸中毒、细胞内钙超载、自由基损害、兴奋性氨基酸毒性所致的NMDA受体的激活、一氧化氮（NO）的作用等，而这些损伤机制并不是独立发挥作用的，在很大程度上是相互重叠和密切联系的[13，14]。脑缺血的治疗目标是尽早恢复血流，改善半暗区的血液供应，抑制缺血再灌所致的损害。Koizumi首先于1986年介绍了一种不开颅的方法，即血管内线栓闭塞法（线栓法)MCA阻塞(MCAO)模型，随之1989年Longa等将该方法加以改进。由于该方法具有不开颅，手术时间短，动物存活时间长，缺血部位恒定，且可以准确控制缺血及再灌时间，所以线栓法MCAO模型是目前最广泛应用于实验研究的一种模型。我们采用颈内动脉线栓法（MCAO）制备大脑中动脉阻塞－再灌注模型，损伤小，稳定性高，方法比较可靠。脑缺血再灌注损伤时最明显的组织学变化是脑水肿及脑细胞的坏死。脑水肿的产生是膜脂质过氧化使膜的结构破坏和钠泵功能障碍的结果。大鼠局部脑缺血再灌注实验证明，TQ0701能够降低缺血再灌注损伤大鼠的神经功能评分和减少梗塞范围。同时组织病理学报告证明TQ0701对大鼠脑缺血所致神经元变性、坏死有一定的治疗作用。因此，TQ0701对大鼠脑缺血-再灌注损伤有良好的保护作用，有一定的研究开发前景。参考文献[1]MarksAR.Intracellularcalcium-releasechannels:regulatorofcelllifeanddeath[J].AmJPhysiology,1997;272:H597.[2]HastedE,BergJ,LongmontIA.Failureofhaloperidoltoprotectagainstcerebralinjurywhengivenafterthestartofhypoxia[J].ActaNeuralScand,1991;[3]ClarkWM,MaddenKP,RatlineR,etal.Reductionofcentralnervoussystermischemicinjuryinrabbitsusingleukocyteadhesionantibod