细菌形态理化鉴定

..>细菌形态理化鉴定TOC\o"1-2"\h\z\u1形态学特征22生理生化特性实验21、尿素酶〔Urease〕试验22、氧化酶〔O*idase〕试验33、过氧化氢酶的测定34、甲基红〔MethylRed〕试验45、V-P试验46、含碳/氮化合物的利用47、葡萄糖的氧化发酵试验〔O-F实验〕58、糖或醇类发酵试验69、硝酸盐〔Nitrate〕复原试验710、靛基质〔Imdole〕试验〔吲哚试验〕711、三糖铁〔TSI〕琼脂试验812、氨基酸脱羧酶的测定813、硫化氢〔H2S〕试验814、柠檬酸盐或丙酸盐的利用915、利用丙二酸盐试验916、葡萄糖酸盐的氧化918、β-半乳糖苷酶〔ONPG〕的测定1019、耐盐性试验1020、卵磷脂酶的测定1021、石蕊牛奶的反响1122、酪素水解试验〔酪蛋白水解〕1123、酪氨酸水解1224、苯丙氨酸脱氨试验1225、产糊精结晶试验1226、从甘油产生二羟基丙酮1227、厌氧硝酸盐产气1228、马尿酸盐水解试验1329、对叠氮化钠的抗性1330、氰化钾试验1331、对溶菌酶抗性的测定1332、在营养肉汤上的生长1333、需氧性试样1434、明胶〔Gelatin〕液化试验1435、淀粉水解试验1436、生长温度的测定1537、形成芽孢的培养基1538、O/129的敏感性试验151形态学特征培养到24h后观察平板上单菌落形状、大小、颜色与突起特征。光学显微镜观察菌体的形态、大小、运动性等。取无油迹的干净载玻片，滴上一滴无菌蒸馏水，用接种环挑取少许菌苔，于水滴边缘轻轻涂几下。自然风干，在火焰上通过几次，固定涂片。滴加结晶紫液，染1min，用水冲净结晶紫液。滴加碘液冲净残水，并覆盖约lmin。用水冲去碘液，将片上的水甩干。滴加95%乙醇液脱色约20-30s，并立即用水冲净乙醇。用番红液染l-2min。用水洗净番红，风干，用显微镜油镜观察涂片。取培养24h左右的菌体涂片、枯燥、固定。滴加3-5滴孔雀绿染液于已固定的涂片上。用木夹夹住载玻片在火焰上加热，使染液冒蒸汽但勿使沸腾，切忌使染液蒸干，必要时可添加少许染液。加热时间从冒蒸汽时开场计时约4-5min。倾去染液，待载玻片冷却后水洗至孔雀绿不再褪色为止。用蕃红水溶液复染lmin，水洗。待枯燥后，置油镜观察，芽孢呈绿色，菌体呈红色。按常规取菌涂片，空气中自然枯燥。用1%的结晶紫水溶液染色2min。以20%的硫酸铜水溶液冲洗，用吸水纸吸干残液。干后用油镜观察。菌体染成深紫色，菌体周围的荚膜呈淡紫色。2生理生化特性实验1、尿素酶〔Urease〕试验有些细菌能产生尿素酶，将尿素分解、产生2个分子的氨，使培养基变为碱性，酚红呈粉红色。尿素酶不是诱导酶，因为不管底物尿素是否存在，细菌均能合成此酶。其活性最适pH为。试验方法：挑取18~24h待试菌培养物大量接种于液体培养基管中，摇均，于36±1℃培养10，60和120min，分别观察结果。或涂布并穿刺接种于琼脂斜面，不要到达底部，留底部作变色对照。培养2，4和24h分别观察结果，如阴性应继续培养至4天，作最终判定，变为粉红色为阳性。培养基配制方法：蛋白胨：1g；NaCl：5g；KH2PO4：2g；葡萄糖1g；琼脂：15g；酚红：0.012g；蒸馏水1000ml。除酚红外，溶解上述成分，并调节PH为6.8～6.9，然后参加酚红指示剂，使培养基呈橙黄色，分装，115℃灭菌20min。待培养基冷至50℃左右，参加预先过滤除菌的20%尿素水溶液，使其终浓度为2%。试验方法：挑取18~24h待试菌培养物大量穿刺接种于琼脂斜面，不要到达底部，培养1～4d观察结果，如为阴性应继续培养一下，作最终判定，变为粉红色为阳性。2、氧化酶〔O*idase〕试验氧化酶亦即细胞色素氧化酶，为细胞色素呼吸酶系统的终末呼吸酶，氧化酶先使细胞色素C氧化，然后此氧化型细胞色素C再使对苯二胺氧化，产生颜色反响。试验方法：在琼脂斜面培养物上或血琼脂平板菌落上滴加试剂1~2滴，阳性者Kovacs氏试剂呈粉红色~深紫色，Ewing氏改进试剂呈蓝色。阴性者无颜色改变。应在数分钟内判定试验结果。本卷须知：盐酸二甲基对苯撑二胺溶液容易氧化，溶液应装在棕色瓶中，并在冰箱内保存，如溶液变为红褐色，即不宜使用。铁、镍铬丝等金属可催化二甲基对苯撑二胺呈红色反响，假设用它来挑取菌苔，会出现假阳性，故必须用白金丝或玻璃棒〔或牙签〕来挑取菌苔。在滤纸上滴加试剂，以刚刚打湿滤纸为宜，如滤纸过湿，会防碍空气与菌苔接触，从而延长了反响时间，造成假阴性。3、过氧化氢酶的测定过氧化氢酶又称接触酶，能催化过氧化氢分解水和氧。试剂：3－10％过氧化氢〔H2O2〕菌种培养：将测试菌种接种于适宜的培养基斜面上，适温培养18－24h。试验方法：取一干净的载波片，在上面滴1滴3－10％的H2O2，挑取1环培养18－24h的菌苔，在H2O2溶液中涂抹，假设有气泡〔氧气〕出现，则为过氧化氢酶阳性，无气泡者为阴性。也可将过氧化氢溶液直接参加斜面上，观察气泡的产生。本卷须知：过氧化氢酶是1种以正铁血红素作为辅基的酶，所以测试菌所生长的培养基不可含有血红素或红血球。4、甲基红〔MethylRed〕试验肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸，进一步分解中，由于糖代谢的途径不同，可产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，可使培养基PH值下降至以下，使甲基红指示剂变红。挑取新的待试纯培养物少许，接种于通用培养基，培养于36±1°C或30°C〔以30°C较好〕3~5天，从第二天起，每日取培养液1ml，加甲基红指示剂1~2滴，阳性呈鲜红色，弱阳性呈淡红色，阴性为黄色。迄至发现阳性或至第5天仍为阴性、即可判定结果。甲基红为酸性指示剂，pH范围为4.4~6.0，其pK值为5.0。故在pH5.0以下，随酸度而增强红色，在pH5.0以上，则随碱度而增强黄色，在pH5.0或上下接近时，可能变色不够明显，此时应延长培养时间，重复试验。5、V-P试验*些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养基中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中氧氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称V－P〔+〕反响。通用培养基配制方法：蛋白胨5g；葡萄糖5g；NaCl/(K2PO4-一般仅用于肠杆菌各菌属鉴定):5g；蒸馏水：1000mL；PH:7.0～7.2，分装试管，毎管装约4～5cm，115℃灭菌20min。试剂：40%NaOH(或KOH)，6%a-萘酚。试验方法：将试验菌接种于上述培养基，于36±1°C培养4天培养48-96小时，培养液2ml先参加1mla-萘酚〔2-na-phthol〕纯酒精溶液，再加40%氢氧化钾水溶液0.4ml，摇动2～5min，阳性菌常立即呈现红色，假设无红色出现，静置于室温或36±1°C恒温箱，如2h内仍不显现红色、可判定为阴性.本试验一般用于肠杆菌科各菌属的鉴别。在用于芽胞杆菌和葡萄球菌等其它细菌时，通用培养基中的磷酸盐可阻碍乙酰甲基醇的产生，故应省去或以氯化钠代替。6、含碳/氮化合物的利用细菌能否利用*些含碳化合物作为唯一碳源，反映该菌是否产生代谢这种化合物的有关酶系，因而作为鉴定依据。测定的根底培养基配方很多，因种而异。现介绍1种合成的根底培养基，有些细菌还可适当补加各种维生素。培养基可制成液体，分装试管，也可制成固体平板。可用于测定的底物种类很多，有单糖、双糖、糖醇、脂肪酸、羟基酸及其他有机酸、醇、各种氨基酸类胺类以及碳氢化合物等。糖的含量一般为1％，醇类酚类等的含量一般为0.1－0.2％，氨基酸的含量一般为0.5％。因碳氢化合物不溶于水，可在液体培养基中振荡培养，或参加到45℃的固体培养基中，振荡后立即倒成平板。有些底物不宜用高压灭菌，可用过滤法灭菌后参加已灭菌的根底培养基中，*些醇类和酚类不必灭菌。接种和观察结果：菌种最好做成悬液，防止带入少量碳源干扰试验结果。平板培养用接种环点种，液体培养则用直针接种。每一测定菌必须接种未加碳水化合物的空白根底培养基作对照。适温培养2、5、7天后观察，凡测定菌在有碳水化合物的培养基中生长情况，明显超过空白培养基的生长量为阳性，否则为阴性。假假设两种培养基上生长情况差异不明显，开在同一培养基上连续移种3次，如差异仍不明显则以阴性论。(葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、木糖、甘露醇、纤维二糖、乳糖、麦芽糖、纤维素粉、甘油、甘露糖。)〔1〕菌株对碳源的利用Mandel盐营养液[54]：NaNO32.0g/L，K2HPO41.5g/L,CaCl21.5g/L,MgSO40.3g/L,Mandel盐营养液+2%琼脂+2%碳源。碳源分别为：葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、蛋白胨水培养基1000mL糖发酵培养基：1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1-2mL，另配20%糖溶液10mL调节pH7.6，115℃灭菌30min，备用。木糖、甘露醇、纤维二糖、乳糖、麦芽糖、纤维素粉、甘油、甘露糖。每支试管内装10mL培养基，制成斜面培养基,无菌下接种，每种碳源接种二管，一支不接种做对照，31℃培养。连续3代移种，生长者为阳性。〔2〕菌株对氮源的利用无氮的Mandel盐营养液+2%琼脂上铺无菌滤纸+1%不同的氮源。氮源分别为：NH4+、NO3-、蛋白胨、酵母膏、尿素，每种氮源制三个斜面，其中一个做对照，无菌条件下接种，31℃培养4d，观察结果。7、葡萄糖的氧化发酵试验〔O-F实验〕在细菌鉴定中，糖类发酵产酸是1项重要依据。细菌对糖类的利用有2种类型：1种是从糖类发酵产酸，不需要以分子氧作为最终受氢体，称发酵型产酸；另一种则以分子氧作为最终受氢体，称氧化型产酸。前者包括的菌种类型为多数。氧化型产酸量较少，所产生的酸常常被培养基中的蛋白胨分解时所产生的胺所中和，而不表现产酸。为此，Hugh和Leifson提出一种含有低有机氮的培养基，用以鉴定细菌从糖类产酸是属氧化型产酸或发酵型产酸。这一试验广泛用于细菌鉴定。一般用葡萄糖作为糖类代表。也可利用这一根底培养基来测定细菌从其他糖类或醇类产酸的能力。〔1〕接种：以18－24h的幼龄菌种，穿刺接种在上述培养基中，每株菌接4管，其中2管用油封盖〔凡士林：液体石蜡＝1：1混合后灭菌〕，约加0.5－1厘米厚，以隔绝空气为闭管。另2管不封油为开管，同时还要有不接种的闭管作对照。适温培养1、2、4、7天观察结果。〔2〕结果观察：氧化型产酸――仅开管产酸，氧化作用弱的菌株往往先在上部产碱〔1－2d〕，后来才稍变酸。发酵型产酸则开管及闭管均产酸，如产气，则在琼脂柱内产生气泡。8、糖或醇类发酵试验原理：不同微生物分解利用糖类的能力有很大差异，或能利用或不能利用，能利用者，或产气或不产气。可用指示剂及发酵管检验。有些细菌分解*些糖〔醇、苷〕产酸〔符号：+〕、产气〔符号：○〕，培养基由紫〔蓝〕变黄〔指示剂溴甲酚紫或溴百里酚蓝由紫或蓝遇酸变黄的结果〕，并有气泡；有些产酸，仅培养基变黄；有些不分解糖类〔符号：－〕，培养基仍为紫〔蓝〕色。培养基配制：一般细菌常用休和李夫森二氏培养基：蛋白胨：2g，K2HPO4:0.2g，NaCl:5g，糖〔醇、糖苷〕：1%，水洗琼脂：5～6g，蒸馏水：1000mL，PH:6.8～7.0，溴百里酚蓝：1%水溶液3mL(先用少量的95%乙醇溶解后，再加水配成1%水溶液)。先调PH后再加指示剂。芽孢杆菌培养基配制：(NH4)2HPO4:1g，MgSO4:0.2g，KCl:0.2g，酵母膏：0.2g，糖〔醇、糖苷〕：1%水洗琼脂：5～6g，蒸馏水：1000mL，溴甲酚紫：0.4%乙醇液2mL，PH:6.8～7.0。先调PH后再加指示剂。将以上培养基分装试管，培养基高度约为4～5cm，115℃灭菌20min。测定的糖〔醇、糖苷〕类可以包括：葡萄糖、蔗糖、甘露糖、乳糖〔1.5%〕、半乳糖〔1.5%〕、D-山梨醇、果糖、阿拉伯糖、麦芽糖、纤维二糖、木糖、水杨苷等。注意：以上亦可用液体培养基。接种和观察结果：用18～24h的幼龄菌种，用穿刺针接种于培养基中，适温培养1d，3d，5d后观察，颜色变黄为阳性，不变为阴性；有气泡产生为产气。结果记录：产酸：+，产气：○，不产酸长气：-。法2试验方法：以无菌操作，用接种针或环移取纯培养物少许，接种于发酵液体培养基管，假设为半固体培养基，则用接种针作穿刺接种。接种后，置36±°C培养，每天观察结果，检视培养基颜色有无改变〔产酸〕，小倒管中有无气泡，微小气泡亦为产气阳性，假设为半固体培养基，则检视沿穿刺线和管壁及管底有无微小气泡，有时还可看出接种菌有无动力，假设有动力、培养物可呈弥散生长。本试验主要是检查细菌对各种糖、醇和糖苷等的发酵能力，从而进展各种细菌的鉴别，因而每次试验，常需同时接种多管。一般常用的指示剂为酚红、溴甲酚紫，溴百里蓝和An-drade指示剂。注：对于糖醇类发酵现在一般用糖、醇类细菌微量生化鉴定管在36℃18－24h即可出结果。9、硝酸盐〔Nitrate〕复原试验有些细菌具有复原硝酸盐的能力，可将硝酸盐复原为亚硝酸盐、氨或氮气等。亚硝酸盐的存在可用硝酸试剂检验。试验方法：临试前将试剂的A〔磺胺酸冰醋酸溶液〕和B〔α－萘胺乙醇溶液〕试液各等量混合、取混合试剂约、加于液体培养物或琼脂斜面培养物外表，立即或于10min内呈现红色即为试验阳性，假设无红色出现则为阴性。用α-萘胺进展试验时，阳性红色消退很快、故参加后应立即判定结果。进展试验时必须有未接种的培养基管作为阴性对照。α-萘胺具有致癌性、故使用时应加注意。硝酸盐复原试验培养基：蛋白胨10g、酵母膏5g、NaCl5g、KNO31g、蒸馏水1000mL调节pH7.2-7.4，121℃灭菌20min，备用。10、靛基质〔Imdole〕试验〔吲哚试验〕*些细菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用显色反响表现出来。吲哚与对二甲基氨基苯醛结合，形成玫瑰吲哚，为红色化合物。试验方法：将待试纯培养物小量接种于试验培养基管，于36±1C培养24h时后，取约2ml培养液，参加Kovacs氏试剂2~3滴，轻摇试管，呈红色为阳性，或先加少量乙醚或二甲苯，摇动试管以提取和浓缩靛基质，待其浮于培养液外表后，再沿试管壁徐缓参加Kovacs氏试剂数滴，在接触面呈红色，即为阳性。实验证明靛基质试剂可与17种不的靛基质化合物作用而产生阳性反响，假设先用二甲苯或乙醚等进展提取，再加试剂，则只有靛基质或5-甲基靛基质在溶剂中呈现红色，因而结果更为可靠。吲哚试验培养基：蛋白胨10g、NaCl5g、蒸馏水1000mL调节pH7.6，121℃灭菌20min，备用法2：试剂：对二甲氨苯甲醛1g、95%乙醇95ml、浓盐酸20ml。配置时，应先用乙醇溶液溶解对二甲氨苯甲醛，再缓慢参加盐酸即成。此试剂不能久存，宜少量配制，并避光保存于冰箱中或阴凉处。试验方法及结果：将细菌纯培养物接种到蛋白胨水培养基中，37℃培养24-72h后，沿管壁缓慢参加2-3ml的试剂于培养物的液面上。在两层液体交界面出现红色环者为阳性，阴性反映者不变色。为了使颜色明显，在参加试剂之前，先向培养物种参加1ml乙醚，并充分振荡，使靛基质溶于乙醚中。静置片刻，使乙醚层浮于培养物的液面。此时，再按上述方法徐徐参加试剂5-10滴，并观察判定结果。11、三糖铁〔TSI〕琼脂试验试验方法：以接种针挑取待试菌可疑菌落或纯培养物，穿刺接种并涂布于斜面，置36±1℃培养18~24h，观察结果。本试验可同时观察乳糖和蔗糖发酵产酸或产酸产气〔变黄〕；产生硫化氢〔变黑〕。葡萄糖被分解产酸可使斜面先变黄，但因量少，生成的少量酸，因接触空气而氧化，加之细菌利用培养基中含氮物质，生成碱性产物，故使斜面后来又变红，底部由于是在厌氧状态下，酸类不被氧化，所以仍保持黄色。12、氨基酸脱羧酶的测定有些细菌含有氨基酸脱羧酶，使羧基释出，生成胺类和二氧化碳。此反响在偏酸的条件下进展。当培养基含胺类时呈碱性反响，使指示剂变色。接种与观察结果：用幼龄培养液作为菌种，直接接种。接种后封油，对照管与测定管同时接种封油。肠肝菌科的细菌于37℃培养4天观察。当指示剂呈紫色或带红色调的紫色者为阳性，呈黄色者为阴性。对照管应呈黄色反响。13、硫化氢〔H2S〕试验有些细菌可分解培养基中含硫氨基酸或含硫化合物，而产生硫化氢气体，硫化氢遇铅盐或低铁盐可生成黑色沉淀物。试验方法：在含有硫代硫酸钠等指示剂的培养基中，沿管壁穿刺接种，于36±1℃培养24~28h，培养基呈黑色为阳性。阴性应继续培养至6天。也可用醋酸铅纸条法：将待试菌接种于一般营养肉汤，再将醋酸铅纸条悬挂于培养基上空，以不会被溅湿为适度；用管塞压住置36±1℃培养1~6天。纸条变黑为阳性。硫化氢试验培养基10%醋酸铅水溶液1mL将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基100mL加热溶解，待冷至60℃时参加硫代硫酸钠0.25g，调至pH7.2，，装入三角瓶中，115℃灭菌15min，取出后待冷至55-60℃，参加10%醋酸铅水溶液〔无菌的〕1mL，混匀即可。14、柠檬酸盐或丙酸盐的利用*些细菌能利用柠檬酸盐或丙酸盐作为碳源，及磷酸胺作为氮源，将柠檬酸分解为二氧化碳，则培养基中由于有游离钠离子存在而呈碱性。接种与观察结果：取幼龄菌种接种于斜面上，适温培养3－7天，培养基呈碱性〔蓝色〕者为阳性反响，不变者则为阴性。培养基：硫酸镁磷酸二氢铵磷酸氢二钾枸橼酸钠氯化钠琼脂蒸馏水990ml制法：将各物〔除溴麝香草酚蓝溶液外〕混合于蒸馏水内，加热溶解，校正pH7.0，再参加溴麝香草酚蓝液，混匀后分装试管，121℃将培养物划线接种。在最正确生长温度培养7d。结果记录：微生物利用柠檬酸何在柠檬酸琼脂上的生长导致了碱性反响，因此培养基中的溴百里芬兰指示剂由绿色变为亮蓝色；如果微生物没有利用柠檬酸且在柠檬酸琼脂上没有生长，则培养基的颜色不发生变化。15、利用丙二酸盐试验丙二酸盐是三羧酸循环中琥珀酸脱氢酶的抑制剂。能否利用丙二酸盐，也是细菌鉴定中的一个鉴别性特征。许多微生物代谢有三羧酸循环，而琥珀酸脱氢是三羧酸循环的一个环节，丙二酸与琥珀酸竞争琥珀酸脱氢酶，与丙二酸不被分解，所以琥珀酸脱氢酶被占据，不能释放出来催化琥珀酸脱氢反响，抑制了三羧酸循环。接种和观察结果：用幼龄菌种接种测定培养基和空白培养基，于适温培养1－2d，观察培养基变色情况。如测定培养基生长并变蓝色，表示可利用丙二酸盐，为阳性结果。反之，如测定培养基未变色，而空白对照培养基生长，则为阴性，即不利用丙二酸盐。16、葡萄糖酸盐的氧化假单胞菌属和肠道杆菌科的细菌，可氧化葡萄糖酸为2－酮基葡萄糖酸。葡萄糖酸无复原性基团，氧化后形成酮基，则可将斐林氏试剂的呈蓝色的铜盐复原为砖红色的Cu2O沉淀。试验方法：用pH7.2的磷酸缓冲液配制成含1％葡萄糖酸盐〔可用葡萄糖酸钠或葡萄糖酸钙〕的溶液。分装试管，每管2mL。刮取适温培养18－24小时的菌苔至2mL的葡萄糖酸盐溶液中制成浓的菌悬液，置30℃过夜，然后每管参加0.5mL的斐林试剂，放在沸水浴中加热10分钟，试管中液体由蓝色变为黄绿，绿橙色或出现红色沉淀者为阳性反响，如溶液不变色者为阴性。17、硫化氢-靛基质-动力〔SIM〕琼脂试验试验方法：以接种针挑取菌落或纯养物穿刺接种约1/2深度，置36±1℃培养18~24h，观察结果。培养物呈现黑色为硫化氢阳性，混浊或沿穿刺线向外生长为有动力，然后加Kovacs氏试剂数滴于培养外表，静置10min，假设试剂呈红色为靛基质阳性。培养基未接种的下部，可作为对照。本试验用于肠杆菌科细菌初步生化筛选，与三糖铁琼脂等联合使用可显著提高筛选成效。18、β-半乳糖苷酶〔ONPG〕的测定本试验应用于肠肝菌科的鉴定。测定步骤：将测定菌接种于TSI斜面上，培养于37℃18h〔或其他最适温度〕挑取1大环菌苔入约0.25mL的生理盐水中制成菌悬液，每管加1滴甲苯，摇匀〔有助于酶的释放〕，于37℃放置5分钟。在菌悬液中参加0.25mL的0.75mol/LONPG，测定管置于37℃水浴培养。经30分、1、2、3、……24h进展观察，如有黄色者则为阳性。19、耐盐性试验本试验是观察渗透压对细菌生长的影响。由于不同菌类耐盐性不同，故常以此作为鉴别特征。一般可根据不同种类的菌株，选择其适合生长的培养基，在其中参加不同量的NaCl，接种后观察其生长与否，以判断其耐盐性。以肉汤培养液根据鉴定需要，配成不同浓度的NaCl，如2％、3.5％、5％、7％、10％等。培养基要求十分澄清，接种时应采用幼龄菌液，直针接种，适温培养3－7d，与未接种的对照管比照，目测生长情况。20、卵磷脂酶的测定菌体如存在有卵磷脂酶，就能使卵磷脂分解生成脂肪和水溶性的磷酸胆碱。接种与观察结果：将测试菌的菌液，环接在有卵黄的试管和不加卵黄的对照管中，适温培养1、3或5天观察。假假设与对照管相比较，在卵黄胰胨液中或外表，形成白色沉淀者，则为阳性反响，表示卵磷脂被分解，生成脂肪和水溶性的磷酸胆碱，说明有卵磷酶的存在。另一种方法：以无菌操作取出卵黄，放入灭菌的三角瓶中，加相当于等量的生理盐水摇匀后，取10mL卵黄液参加到溶化的约50－55℃的200mL肉汁胨琼脂培养基中，混合均匀后倒入培养皿，制成卵黄平板，过夜后即可使用。接种与观察结果：将测试菌点接在卵黄平板上，每皿可分散点接4－5株菌、〔芽孢杆菌以点接1－2株菌为宜〕以不影响结果观察为度，如测试厌氧菌，则须在上面加盖无菌的盖玻片。每株菌至少重复点接两皿。适温培养1－2d观察，在菌落周围形成乳白色混浊环，表示卵磷脂被分解，生成脂肪，说明该菌株有卵磷脂酶存在。21、石蕊牛奶的反响牛奶中主要含有乳糖和酪蛋白，在牛奶中参加石蕊是作为酸碱指示剂和氧化复原指示剂。石蕊在中性时呈淡紫色，酸性时呈粉红色，碱性呈蓝色，复原时则自上而下地褪色变白。细菌对牛奶的作用有一下几种：产酸――细菌发酵乳糖产酸，使石蕊变红。产碱――细菌分解酪蛋白产生碱性物质，使石蕊变蓝。胨化――细菌产生蛋白酶，使酪蛋白分解，故牛奶变得比较澄清。酸凝固――细菌发酵乳糖产酸，使石蕊变化，当酸度很高时，可使牛奶凝固。凝乳酶凝固――有些细菌能产生凝乳酶，使牛奶中的酪蛋白凝固，此时石蕊常呈蓝色或不变色。复原――细菌生长旺盛，使培养基氧化复原电位降低，因此石蕊复原褪色。接种与观察结果：接种待测菌株，适温培养3、5、7d或14d，按上述特征观察和记录牛奶产酸、产碱、凝固或胨化等反响。培养基：脱脂乳粉100g溶于1000ml蒸馏水中。每100ml脱脂牛奶参加4ml浓度为25g/l〔石蕊，100ml蒸馏水，放置一夜或更长时间，过滤〕的石蕊牛奶。分装试管，牛奶高度4-5cm。113℃高压蒸汽灭菌15-20min。22、酪素水解试验〔酪蛋白水解〕牛奶平板的制备：取5g脱脂奶粉参加50mL蒸馏水中〔或用50mL脱脂牛奶〕，另称1.5g琼脂溶于50mL蒸馏水中，将两液分开灭菌。待冷至45－50℃时，将两液混匀倒平板，即成牛奶平板。将平板倒置过夜，使外表水分枯燥，然后将菌种点接在平板上，每皿可点接3－5株菌。适温培养1、3、5天，记录菌落周围和下面酪素是否已被分解而呈透明。配制该培养基时，切勿将牛奶和琼脂混合灭菌，以防牛奶凝固。23、酪氨酸水解将L－酪氨酸0.5g悬浮于10mL蒸馏水中，8磅20分钟灭菌，然后于100mL无菌的营养肉汤琼脂混合，倾倒平板，待凝固后，将测试菌接种于平皿上，培养7到14d，记录酪氨酸结晶是否被水解而变透明。24、苯丙氨酸脱氨试验*些细菌〔如变形杆菌〕具有苯丙氨酸脱氨酶，能将苯丙氨酸氧化脱氨，形成苯丙酮酸，苯丙酮酸遇到三氯化铁呈蓝绿色。本试验用于肠肝菌科和*些芽孢杆菌属的鉴定。接种与观察结果：将菌种接种于该培养基斜面上，适温培养3－7d〔*些芽孢杆菌须培养21d〕。取10％的FeCl3水溶液4－5滴，滴加在生长菌苔的斜面上，当斜面和试剂液面处呈蓝绿色时为阳性反响，表示从苯丙氨酸形成苯丙酮酸。25、产糊精结晶试验*些需氧芽孢杆菌能产生淀粉酶，使淀粉水解为糊精。该反响仅用于区别多粘芽孢菌，浸麻芽孢菌和环状芽孢菌的培养物。在大试管中〔200*20mm〕装碾过的小麦〔或燕麦〕0.5g，CaCO30.2g，蒸馏水10mL，灭菌后接种，35℃培养3、5和7d后，取1滴卢哥尔氏碘液混匀，枯燥后，用显微镜观察有暗褐色或蓝色的六角形结晶的糊精，假假设大量形成，则排列为扇形或针状。26、从甘油产生二羟基丙酮本试验主要是用于区分醋酸单胞菌属和假单胞菌属以及*些芽孢杆菌的鉴定。生酮反响是由相应的多元醇的脱氢酶的作用，此反响就是测定有否这些脱氢酶。接种与观察结果：融化三角瓶中的培养基，倒成平板，凝固后在平板上划短线接种，适温培养10天，在平板上倒入斐林试剂A、B混合液，以覆盖菌落为度，2小时内检查，假设在菌落周围出现红色的晕者为阳性反响。为了能掌握这一试验，可接种多粘芽孢杆菌作阳性对照。27、厌氧硝酸盐产气在厌氧情况下，有些好氧细菌，能以硝酸盐代替分子氧作为受氢体，进展厌氧呼吸，将硝酸盐复原为气态氮，即为土壤中的反硝化作用。*些芽孢杆菌，假单胞菌及产碱菌等属的细菌具有此反响。接种封油：以斜面菌种用接种环接种后，用凡士林油〔凡士林和液体石蜡为1：1〕封管，封油的高度约1厘米。必须同时接种不含有硝酸钾的肉汁胨培养液作对照。观察结果：培养2－7d，观察在含有硝酸钾的培养基中有否生长和产生气泡。如有气泡产生，表示反硝化作用产生氮气，为阳性反响。但如不含硝酸钾的对照培养基也可产生气泡，则只能按可疑或阴性处理。28、马尿酸盐水解试验本试验作为区分*些芽孢杆菌的鉴定和黄单胞菌属的鉴定之用。接种和观察结果：以幼龄菌种接种于上述培养液中，适温培养4周〔高温芽孢菌培养2周〕，取1mL培养物，和1.5mL50％的；硫酸混合，静置片刻，在酸性混合物中有针状结晶出现为阳性，证明从马尿酸盐形成安息香酸。29、对叠氮化钠的抗性本试验用于高温芽孢杆菌的测定。接种和观察结果：取1环幼龄的菌液，接种于上述培养基中，同时接种营养肉汤作为对照。45℃培养7至14d观察生长情况。30、氰化钾试验氰化钾〔KCN〕是呼吸链末端抑制剂。能否在含有氰化钾的培养基中生长，是鉴别肠杆菌科各属常用的特征之一。接种和观察结果：用幼龄菌种接种于加氰化钾的测定培养基和未加氰化钾的空白培养基中，适温培养1－2d，观察生长情况。能在测定培养基上生长者，表示氰化钾对测定菌无毒害作用，为阳性。假设在测定培养基和空白培养基上均不生长，表示空白培养基的营养成分不适于测定菌的生长，必须选用其它适宜的培养基。而测定菌在空白培养基上能生长，在含氰化钾的测定培养基上不生长，为阴性结果。应该注意：氰化钾是剧毒药品，操作时必须小心。培养基用毕，每管加几粒硫酸亚铁和0.5mL20％KOH以解毒，然后清洗。31、对溶菌酶抗性的测定在100mL的三角瓶中，放入60－65mL无菌的0.01mol/LHCL，在其中参加0.1g溶菌酶，瓶上塞无菌棉花，在小火上煮沸20分钟后，冷到室温，加无菌的0.01mol/LHCL补足到100mL。取1mL溶菌酶溶液与99mL无菌的肉汤培养液混合，分装无菌试管，每管2.5mL，在含有0.001％溶菌酶肉汤管子及无溶菌酶的营养肉汤对照管中，各接种1环菌液，适温培养5－7d，记录两管的生长情况。本试验应用于芽孢杆菌属中种的鉴定。接种和观察结果：取菌液一环，接种于上述培养基中，同时接种普通肉汤液〔7.2pH〕作对照。适温培养1－3d后观察生长情况。该培养液要求十分澄清，pH必须准确，最好用pH计调测。33、需氧性试样假设在培养基中参加复原剂，如巯基醋酸钠和甲醛次硫酸钠等，以除去培养基中的氧气或氧化型物质，使厌氧菌能在有氧情况下生长。接种与观察结果：用1小环〔外径1.5毫米的接种环〕的肉汤菌液，穿刺接种到上述培养基中，必须穿刺到管底。30℃培养，分别在3至7天观察结果。如细菌在琼脂柱外表上生长者为好氧菌，如沿着穿刺线上生长者为厌氧菌或兼性厌氧菌。34、明胶〔Gelatin〕液化试验有些细菌具有明胶酶〔亦称类蛋白水解酶〕，能将明胶先水解为多肽，又进一步水解为氨基酸，失去凝胶性质而液化。试验方法：挑取18~24h待试菌培养物，以较大量穿刺接种于明胶高层约2/3深度或点种于平板培养基。于20~22℃培养7~14天。明胶高层亦可培养于36±1℃。每天观察结果，假设因培养温度高而使明胶本身液化时应不加摇动、静置冰箱中待其凝固后、再观察其是否被细菌液化，如确被液化，即为试验阳性。平板试验结果的观察为在培