超声提取草莓茎叶中原花青素的工艺研究

超声提取草莓茎叶中原花青素的工艺研究刘厚禄,杨雪,颜梅,伍春游四川师范大学生命科学学院四川成都摘要：优化草莓茎叶中原花青素超声波辅助提取工艺。方法：采用超声辅助法，从料液比、乙醇浓度、提取温度、超声时间、提取次数五个方面进行比较,在这些单因素试验的基础上，采用正交优化试验，对提取工艺进行了优化。结果：影响原花青素得率的因素是:提取次数＞乙醇浓度＞料液比＞温度>提取时间；结论：超声波提取法的适宜提取条件为:乙醇浓度40%、提取时间15min、提取温度30℃、料液比1:15、提取次数3次，原花青素的得率最高。关键词：草莓；茎叶；超声提取；原花青素StudyonUltrasonicExtractionTechnologyofProcyanidinfromStrawberryStemandLeafLiuHou-lu,YangXue,YanMei,WuChun-youCollegeofLifeScience,SichuanNormalUniversity,ChengduSichuanAbstract:ObjectiveTooptimizetheultrasonicassistedextractiontechnologyofprocyanidinfromStrawberryStemandLeaf.MethodsUsingultrasonicassistedextractionmethod,wecomparedthesolid-liquidratio,ethanolconcentration,extractiontemperature,ultrasoundtimeandextractiontimes.Basedonthesinglefactortest,extractiontechnologywasoptimizedbyorthogonaltest．ResultsTheinfluencefactorsofyieldrateofprocyanidinwereasfollows:extractiontimes>ethanolconcentration>solid-liquidratio>extractiontemperature>extractiontime.ConclusionTheoptimumconditionswereasfollows:theethanolconcentrationwas40%,solid-liquidratiowas1:15,extractiontemperaturewasat30℃，extractedfor15minandeachfor3times．Keywords:strawberry;stemandleaf;ultrasonicextraction;procyanidin原花青素(Proanthocyanidins,简称PC)是植物界中广泛存在的聚多酚类混合物,主要是由不同数目的儿茶素、表儿茶素（黄烷-3-醇或黄烷-3,4-二醇）等聚合而成[1]。经多年药理学研究和临床应用发现：原花青素的抗氧化特性极强，具有降血压、降血脂、消炎、抗癌、治疗心血管疾病、抗辐射、抗突变、促进骨和抑制龋齿发生等功效。目前在食品、保健品、药品、化妆品等领域已有所应用，在欧美等国家享有“皮肤维生素”和“口服化妆品”的美誉[2]。研究表明PC一般存在于植物的果实、种子、花和皮中,在葡萄、山楂、草莓、花生、银杏、白桦树、松树等植物中的含量都很丰富[3]。草莓为蔷激科草莓属的常绿草本植物,营养价值高，是世界七大水果之一,经过30年的发展，我国草莓的栽培面积和产量均己跃居世界第一位[4]。关于草莓果实原花青素的研究已有报道，但还未见对草莓茎叶的研究。目前在草莓的栽培过程中，对摘取果实后所剩的草莓茎叶直接丢弃未加利用，为了提高草莓种植的综合经济价值，减少农业生产中的废物排放，促进现代农业环境友好型发展，因此研究草莓茎叶原花青素提取工艺并分析其成分具有重要经济和生态价值。由于PC组成和结构的复杂性,其在植物组织中的提取及组分含量的准确表征始终是困扰市场的一个技术难题。天然原花青素的提取方法包括有机溶剂提取、微波提取、超声波提取、超临界CO2萃取以及酶法等[5]，其中超声波空化可以从稳态空化转化成瞬态空化，吸收的能量在极短的时间和极小的空间内释放出来，从而破坏细胞壁结构，使其在瞬间破裂，释放细胞内的有效成分，提高提取效率，缩短提取时间，在提取原花青素之类的热敏性物质显示出了优越的性能[6]-[8]，原花青素的分析方法有Bate-Smith法、香草醛分析法、钨钼酸法、HPLC法、示波极谱分析法等[9]。因此，本实验采用超声波提取方式,采用正交优化试验优化草莓茎叶中的原花青素的提取工艺，以儿茶素作为标准对照品，用香草醛-浓盐酸法测定原花青素的含量，为草莓茎叶的综合开发提供理论依据。材料与设备一、材料与试剂草莓茎叶（采自双流草莓基地），洗净，40℃烘干至恒重后，粉碎过20目筛，备用。化学对照品：儿茶素标品（购于四川天然产物研究开发有限公司）；香草醛(分析纯)、盐酸(分析纯乙醇(分析纯)、甲醇(分析纯)（购于成都科龙有限公司)。二、仪器与设备FW80型粉碎机天津泰斯特仪器有限公司；IOTAVATO12-124型旋转蒸发仪德国Buchi公司；HWS-24型恒温水浴锅上海一恒科技有限公司；HZF-211型真空干燥箱上海弘越实验设备有限公司；UV-2450型紫外分光光度计日本岛津公司。实验方法一、原花青素的含量测定方法采用香草醛-浓盐酸法测定原花青素类物质的总含量[10]。（一）标准曲线绘制精确称量20.00mg标准品儿茶素标准品用50%乙醇定容至20ml制成1000ug/ml的标准母液；精确量取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7ml标准母液在10ml的容量瓶，依次各加入6ml1%香草醛甲醇溶液和3ml浓盐酸，并用50%乙醇定容，分别得到10、20、30、40、50、60、70ug/ml的标准液，避光反应30min；以体积比VA:VB:VC=6:3:1(其中A为1%香草醛甲醇溶液；B为浓盐酸；C为50%乙醇溶液)为空白对照测定在500nm处的光吸收值[11]；以标准品儿茶素的浓度为纵坐标y，500nm处吸光度值为横坐标x绘制标准曲线建立标准曲线：y=1.8839x－0.0223，R2=0.9997。（二）样品测定分别吸取1ml待测样品提取液于10ml容量瓶，与标准对照品相同方法显色，依次移取6ml1%（m：v）香草醛--甲醇溶液、3ml浓盐酸溶液遮光显色反应30min，取出显色后的溶液测定在500nm处的光吸收值。每个处理样设三次平行试验。原青花素含量A=X×V×10-3×1/M式中：原青花素含量AW(%)；X根据标准曲线求得的测量样品中原花青素浓度(μg/ml)；V为样品提取液定容以后的体积（ml）；M提取样品质量（g）二、单因素试验（一）提取温度的影响称取1.000g草莓茎叶样品3份，以40%乙醇作为提取溶剂，按1∶15（g/ml）的料液比加入，超声波功率200W，温度分别为20、30、40、50、60、70、80℃，在超声波提取器中震荡提取30min，重复提取三次，合并提取液，4000r/min冷冻离心10min，过滤，定容至100ml；按照样品测定方法得A500nm值。（二）乙醇浓度对原花青素含量的影响称取1.000g草莓茎叶样品3份，分别选择20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液，按1∶15（g/ml）的料液比加入，超声波功率200W，温度30℃，在超声波提取器中震荡提取30min，重复提取三次，合并提取液，4000r/min冷冻离心10min，过滤，定容至100ml，按照样品测定方法得A500nm值。（三）料液比对原花青素含量的影响称取1.000g草莓茎叶样品3份，以40%乙醇作为提取溶剂，分别按1:5、1:10、1:15、1:20、1:25的料液比加入，超声波功率200W，温度30℃，在超声波提取器中震荡提取30min，重复提取三次，合并提取液，4000r/min冷冻离心10min，过滤，定容至100ml；按照样品测定方法得A500nm值。（四）提取时间对原花青素含量的影响称取1.000g草莓茎叶样品3份，以40%乙醇作为提取溶剂，料液为比1:15，超声波功率200W，温度30℃，分别在超声波提取器中震荡提取15、30、45、75min，重复提取三次，合并提取液，4000r/min冷冻离心10min，过滤，定容至100ml；按照样品测定方法得A500nm值。（五）提取次数对原花青素含量的影响称取1.000g草莓茎叶样品3份，以40%乙醇作为提取溶剂，料液为比1:15，超声波功率200W，温度30℃，在超声波提取器中震荡提取30min，分别提取1、2、3、4次，合并提取液，4000r/min冷冻离心10min，过滤，定容至100ml；测量A500nm值，按照样品测定方法得A500nm值。三、草莓茎叶原花青素提取条件的优化根据单因素考察的乙醇浓度、料液比、提取温度、提取时间、提取次数对原花青素原花青素含量的综合影响，选取对其影响最大的4个因素——提取温度、提取次数、乙醇浓度和料液比，采用L8（27）正交表设计正交优化试验，因素水平安排见表1、实验设计见表2。表1正交试验设计因素水平表因素A料液比B乙醇浓度C提取次数D提取温度水平11:1520%2次30℃水平21:2040%3次50℃表2正交试验L8(27)设计表实验编号ABA*BCA*C误差D1111111121112222312211224122221152121212621221217221122182212112结果与分析一、单因素试验对草莓茎叶中原花青素原花青素含量的影响（一）提取温度对原花青素含量的影响图1提取温度对原花青素含量的影响影响对不同温度条件下的提取液进行原花青素含量测定可知，随着温度的上升，原花青素含量也随之增大，在30℃达到最大值且趋于平衡，随着温度进一步升高，原花青素含量呈下降趋势，这因为原花青素在高温易被氧化，温度越高可能原花青素的结构越容易被破坏，活性成分损失很大，因此提取温度不宜超过70℃。结果见图１。图1提取温度对原花青素含量的影响影响（二）乙醇浓度对原花青素含量的影响图2乙醇浓度对原花青素含量的影响由图2可知，随着乙醇浓度的增大，原花青素的原花青素含量也逐渐升高，在乙醇浓度为40%时达到最大值，随后随着乙醇浓度的增大原花青素含量趋于平缓，这是因为水在溶剂中起到穿透细胞壁的作用，在提取过程中有利于原花青素的析出，若溶剂中含水量过低时溶剂对细胞壁的穿透作用下降导致原花青素含量不在上升，因此最佳体积分数为40%。图2乙醇浓度对原花青素含量的影响（三）料液比对原花青素含量的影响由图3可知，随着料液比的减小原花青素原花青素含量逐渐增加，在料液比为1:20后，原花青素含量呈稳定的趋势，说明此时原花青素已经接近析出完全，继续减小料液比会造成后续步骤加压蒸馏时间的延长和溶剂的浪费，因此最佳料液比为1:20。图3料液比对原花青素含量的影响图3料液比对原花青素含量的影响（四）提取时间对原花青素含量的影响图4提取时间对原花青素含量的影响由图4可知，原花青素含量随时间的延长逐渐增加，但增加趋势不明显，在30min以后，原花青素含量几乎保持不变，可能原因是随着反应时间的延长，原花青素被空气中的氧气氧化从而导致结构发生改变。图4提取时间对原花青素含量的影响（五）提取次数对原花青素含量的影响由图5可知，原花青素含量随提取次数的增加逐渐增大，在提取次数为2次前原花青素原花青素含量急速增大，随着提取次数的增多，其浸出率增大速率逐渐减慢，在提取3次时大部分已经被浸出，继续增加提取次数，仪器和试剂的损耗大于原花青素含量升高带来的价值，因此，最佳提取次数为3次。图５提取次数对原花青素含量的影响图５提取次数对原花青素含量的影响二、正交优化试验结果经过极差及偏差平方和等分析(表4)得知：拟误差项的极差及偏差平方和均小于实验设计中所有考察因素的极差及偏差平方和，说明实验优化所得结果可靠；通过各因素极差的大小比较可知，对原花青素提取率的影响程度为C>B>A>D,即：提取次数＞乙醇浓度＞料液比＞提取温度；比较各个因素的F比值和F临界值，其中乙醇浓度和提取次数两个因素的F比>F临界值,因此这两个因素对原花青素的提取具有影响显著；通过各实验组的提取率的比较，最佳条件是A1B1C2D1，即料液比1:15、乙醇浓度20%、提取次数为3次、提取温度30℃。但综合考虑乙醇浓度和提取次数对原花青素提取率影响显著，结合单因素实验结果选择乙醇浓度为40%时提取率最大，因此本实验最终选择A1B2C2D1，即提取工艺参数为提取温度30℃、乙醇浓度40%、提取次数为3次、料液比为1:15。在该条件下重复实验3次后测定原花青素含量为3.88%、3.82%、3.85%，RSD值为0.779%，验证了正交优化条件的可靠性。表3正交试验结果分析表实验编号ABA*BCA*C误差D原花青素含量实验111111112.05%实验211112223.16%实验311221123.03%实验411222213.48%实验522121213.08%实验622122123.15%实验722211223.28%实验822212113.36%偏差平方和8.21014.7040.50914.8232.7420.0894.050F比92.247165.2136.697166.55130.80945.506F临界值161.00161.00161.00161.00161.00161.00161.00显著性**均值114.65514.31315.39614.30715.08315.56314.957均值216.68117.02415.94117.03016.25415.77416.380极差2.0262.7110.5452.7231.7710.2111.423结语本实验以草莓茎叶为原材料，采用超声辅助法，从料液比、乙醇浓度、提取温度、超声时间、提取次数等五个方面进行比较,在这些单因素试验的基础上，采用正交优化试验，对提取工艺进行了优化，实验结果表明影响原花青素提取率的因素是:提取次数＞乙醇浓度＞料液比＞温度>提取时间；最佳超声波提取法提取条件为:乙醇浓度40%、提取时间15min、提取温度30℃、料液比1:15、提取次数3次；在该条件下原花青素平均提取含量为3.85%。由文献可知草莓果实中的原花青素含量为1.93%[11]，远低于草莓茎叶中的原花青素含量，同时与其他文献比较可知，草莓茎叶的原花青素含量也高于松树皮[12]、野生粉叶爬山虎种子果梗部位[13]等材料，因此，草莓茎叶可以作为一种新的的原花青素生产原料。至今还未见对草莓茎叶利用的相关报道。本研究通过优化所得原花青素的提取工艺方法简单、操作性强，为今后草莓茎叶中原花青素的开发和利用奠定基础，对草莓的综合利用与开发提供了科学的理论依据。参考文献[1]丁丽,王敏,杜连祥.荔枝核中黄烷-3-醇的鉴定及原花青