植物基因克隆方法

关于植物基因克隆方法第1页，共47页，2022年，5月20日，1点58分，星期五

一、基因克隆（分子克隆molecularcloning）通过体外重组技术,将一段目的DNA经切割、连接插入适当载体，并导入受体细胞，扩增形成大量子代分子的过程。二、基因克隆的核心---体外重组(Recombination)人工将一段目的DNA插入一个载体的过程。第2页，共47页，2022年，5月20日，1点58分，星期五载体DNA（vector）目的DNA（targetfragment）重组DNA（recombinantDNA）宿主（host）筛选、扩增克隆（clone）基因克隆的路线DNA重组转化第3页，共47页，2022年，5月20日，1点58分，星期五

用何种方法取决于基因产物（Geneproducts）的丰度以及gene的相关背景知识，如geneoritsprotein的表达模式及初级结构等

（一）已知基因产物的基因分离（二）未知基因产物的基因分离第4页，共47页，2022年，5月20日，1点58分，星期五（一）已知Geneproducts的基因分离1、利用DNA探针筛选基因文库前提是已知一段DNA序列并构建了基因文库●

同源(homologous)DNA探针

为了克隆一个完整基因结构或研究调节序列。●

异源(Heterologous)DNA探针利用一种植物的一段DNA序列作探针，从其它植物中克隆同源基因注意：有的基因在不同物种间同源性很高，有的则很低。第5页，共47页，2022年，5月20日，1点58分，星期五2、利用protein信息分离基因前提是所研究的protein可以从植物中分离纯化●利用antibody筛选表达文库(ExpressionLibrary)

AntibodyproductionConstructionofExpressionLibrary●利用protein测序的氨基酸信息

Probe(oligonucleotides)Primer(degeneratedprimer)第6页，共47页，2022年，5月20日，1点58分，星期五(b)

Oligonucleotideprobesorgeneratedprimersforgeneswhosetranslationproductshavebeencharacterized

p176Trp-Asp-Glu-Asn-Asn-Met122221(16species)Ser-Glu-Try-Leu-Thr-Asn622642(1152species)第7页，共47页，2022年，5月20日，1点58分，星期五第8页，共47页，2022年，5月20日，1点58分，星期五RT-PCRandRACEPCRReverseTranscription,RapidAmplificationofcDNAEnds第9页，共47页，2022年，5月20日，1点58分，星期五问题1：在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物。

原因：

1）RNA被降解

建议解决方法：利用无污染技术分离RNA；

如果使用RNase抑制剂，不要加热超过45℃或pH超过8.0。

2）RNA中包含逆转录抑制剂

建议解决方法：

通过乙醇沉淀RNA除去抑制剂。用70％（v/v）乙醇对RNA沉淀进行清洗。

逆转录抑制剂包括：SDS，EDTA，甘油，焦磷酸钠，甲酰胺和胍盐。

RT-PCR实验中的常见问题与对策第10页，共47页，2022年，5月20日，1点58分，星期五3）多糖同RNA共沉淀

建议解决方法：

使用氯化锂沉淀RNA以除去多糖。4）起始RNA量不够

建议解决方法：增加RNA量。

对于＜50ng的RNA样品，可以在第一链cDNA合成中使用0.1μg到0.5μg乙酰BSA。

5）RNA模板二级结构太多

建议解决方法：

将RNA和引物在不含盐及缓冲液条件下变性/退火.提高逆转录反应温度，对SuperScriptⅡ可以到50℃，对ThermoScript可以到65℃。

注意：不要在＞60℃时使用oligo(dT)引物，选择一个在反应温度可以退火的GSP。对于＞1kb的RT-PCR产物，保持反应温度≤65℃。

注意：不要在高于37℃时使用M-MLV。

如果不需要全长cDNA，在第一链反应中使用随机引物。

第11页，共47页，2022年，5月20日，1点58分，星期五6）PCR引物设计较差

建议解决方法：

避免在引物3‘端含有互补序列。避免可以形成内部发卡结构的序列。设计Tm类似的引物。

7）镁离子浓度太低

建议解决方法：

从1mM到3mM，间隔0.5mM进行一系列反应，确定对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度。8）退火温度太高

建议解决方法：

把退火温度设定为低于Tm5℃。因为公式估算Tm值比所有真正的退火温度实际会高些或低些。

9）富含GC的模板

建议解决方法：

对于GC含量＞50％的模板，使用PCRxEnhancerSolution。

第12页，共47页，2022年，5月20日，1点58分，星期五问题2：在琼脂糖凝胶分析中观察到非预期条带。

原因：

1）引物和模板非特异性退火

建议解决方法：

以2℃到5℃间隔增加退火温度，减少退火时间。

在开始几个循环使用较高的退火温度，然后使用较低的退火温度。

使用PlatinumTaqDNA进行自动热启动PCR。

2）引物设计较差

避免在引物3‘端含有2到3个dG或dC。3）RNA中沾染了基因组DNA

4）镁离子浓度太高

建议解决方法：

优化镁离子浓度。

5）因为扩增复杂模板导致引物错误起始

建议解决方法：

使用巢式PCR或递减PCR。

第13页，共47页，2022年，5月20日，1点58分，星期五RACEPCR第14页，共47页，2022年，5月20日，1点58分，星期五PCR和细胞内DNA复制的相同点：（1）两者都符合半保留复制模型，即两条链都可作为模板，子代链中一条链来自于亲代链，另一条链是新合成的（2）两者都需要引物（3）两者都需要依赖DNA的DNA聚合酶（4）两者的底物都是dNTP（5）DNA合成时都是在DNA聚合酶作用下按碱基配对原则往3’-OH上加dNTP，形成3’，5’磷酸二酯键（6）两者新合成链延伸的方向都是5’to3’（7）两者DNA合成的保真度（精确性）都较高第15页，共47页，2022年，5月20日，1点58分，星期五PCR和细胞内DNA复制的不同点：（1）复制为半不连续复制，而PCR两条链的合成都是连续的（2）复制时引物是由引发酶或引发体合成的，而PCR引物是在反应前加到反应体系中（3）复制需要在特定的复制原点起始，并且有终止点，而PCR在有特异引物存在时在任何序列都可起始，并且没有终止点（4）复制时两条模板链是在解旋酶的作用下局部打开双链，而PCR两条模板链通过变性完全打开双链（5）复制时两条链的合成是同步进行的，而PCR两条链的合成可能不同步（6）PCR的DNA聚合酶为耐热的DNA聚合酶，而复制的聚合酶一般不耐热（7）复制一般为双向复制，而PCR反应中DNA合成是单向的（8）复制时由多种蛋白因子参与，而PCR只有DNA聚合酶参与第16页，共47页，2022年，5月20日，1点58分，星期五（二）未知Geneproducts的基因分离1、差异杂交筛选（differentialhybridizationscreening）

2、mRNA差异显示(differentialdisplay)3、DNA表达文库（expressionlibrary）

4、DNA结合蛋白基因的分离

5、信号传递蛋白基因的分离

6、图位克隆技术（Map-basedcloning）第17页，共47页，2022年，5月20日，1点58分，星期五建库法cDNALibraryab第18页，共47页，2022年，5月20日，1点58分，星期五传统mRNA差异显示技术（DDRT-PCR）是根据绝大多数真核细胞mRNA3’端具有的多聚腺苷酸尾（polyA）结构，因此可用含oligo（dT）的寡聚核苷酸为引物将不同的mRNA反转录成cDNA。该方法的创始人LiangP和PardeeA根据PolyA序列起点前2个碱基除AA外只有12种可能性的特征，设计合成了12种下游引物，称3’-锚定引物，其通式为5’-T11MN；同时为扩增出polyA上游500bp以内所有可能性的mRNA序列，在5′端又设计了20种10bp长的随机引物。这样构成的引物对进行PCR扩增能产生出20000条左右的DNA条带，其中每一条都代表一种特定mRNA种，这一数字大体涵盖了在一定发育阶段某种细胞类型中所表达的全部mRNA。将差别表达条带中的DNA回收，扩增至所需含量，进行Southernblot或Northernblot或直接测序，从而对差异条带鉴定分析，以便最终获得差异表达的目的基因。第19页，共47页，2022年，5月20日，1点58分，星期五mRNA差异显示(differentialdisplay)第20页，共47页，2022年，5月20日，1点58分，星期五表达文库法第21页，共47页，2022年，5月20日，1点58分，星期五从基因文库的功能上看可分为克隆文库及表达文库。克隆文库由克隆载体构建。载体中具复制子、多克隆位点及选择标记，可通过细菌培养使克隆片断大量增殖。表达文库是用表达载体构建。载体中除上述元件外，还具有控制基因表达的序列(如启动子、SD序列、ATG、终止子等)，可在宿主细胞中表达出克隆片段的编码产物。表达载体又有融合蛋白表达载体及天然蛋白表达载体之分。从克隆文库中分离目的克隆时主要利用核酸探针，可以是根据蛋白质序列合成的寡核苷酸探针，也可以是同种或同属生物的同源序列探针。从表达文库中分离目的克隆时，因克隆片段的表达产物蛋白质具有抗原性及生物活性，所以除核酸探针外，还可以利用免疫学探针及生物功能进行筛选。表达文库适合于那些不知道蛋白质的氨基酸序列、不能用核酸类探针筛选的目的基因的分离。

第22页，共47页，2022年，5月20日，1点58分，星期五1、差异杂交筛选（differentialhybridizationscreening）

2、mRNA差异显示(differentialdisplay)3、DNA表达文库（expressionlibrary）

4、DNA结合蛋白基因的分离

5、信号传递蛋白基因的分离

6、图位克隆技术（Map-basedcloning）利用表达文库利用酵母单杂交第23页，共47页，2022年，5月20日，1点58分，星期五Promoterstructure3’noncodingregion5’noncoding

regioncodingregionPromoterregion0ATG●-75-25TATACAATEnhancerSilencerOthercontrolsequenceCore

promoterTerminationsignal第24页，共47页，2022年，5月20日，1点58分，星期五DNA结合蛋白第25页，共47页，2022年，5月20日，1点58分，星期五a.DNA结合域-DNAbindingdomain，简称DNA-BD，它可识别效应基因上游的一段特定的区段，即上游激活序列(up-streamactivatingsequence,UAS)，并与之结合。b.转录激活域-Transcriptionalactivationdomain，简称AD，它通过同转录机(transcriptionmachinery)中的其它成分的结合作用，启动UAS下游的基因进行转录。

转录因子的两个主要结构域：

第26页，共47页，2022年，5月20日，1点58分，星期五酵母单杂交(yeastonehybrid)技术是体外分析DNA与细胞内蛋白质相互作用的一种方法，通过对酵母细胞内报告基因表达状况的分析，来鉴别DNA结合位点并发现潜在的结合蛋白基因，或对DNA结合位点进行分析.运用此技术，能筛选到与DNA结合的蛋白质，并可直接从基因文库中得到编码该蛋白质的核苷酸序列，而无需复杂的蛋白质分离纯化操作。目前认为真核生物的转录起始需要转录因子的参与。这些转录因子通常由一个DNA结合域（BD)和一个或多个与其他调控蛋白相互作用的转录激活域（AD）组成。用于酵母单杂交系统的酵母GAL4蛋白即是一种典型的转录因子。酵母单杂交Yeastone-hybridsystem第27页，共47页，2022年，5月20日，1点58分，星期五GAL4的DNA结合域靠近羧基端,含有几个锌指结构,可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位点(UAS);而转录激活结构域可与RNA聚合酶或转录因子TFIID相互作用，提高RNA聚合酶的活性.在这一过程中，DNA结合结构域和转录激活结构域可完全独立地发挥作用.据此，我们可将GAL4的DNA结合结构域置换为其他蛋白，只要他能与我们想要了解的目的基因相互作用，就照样可以通过其转录激活结构域激活RNA聚合酶，从而启动对下游报告基因的转录。正是基于这一理论，酵母单杂交系统由2部分组成：(1)将文库蛋白片段与GAL4转录激活域融合表达的cDNA文库质粒；(2)含有目的基因和下游报告基因的报告质粒。首先将报告质粒整合入酵母基因组,产生带有目的基因的酵母报告株；再将文库质粒转化入报告株；若存在文库蛋白与目的基因相互作用,可通过对报告基因的表达将文库蛋白的基因筛选出来.

第28页，共47页，2022年，5月20日，1点58分，星期五第29页，共47页，2022年，5月20日，1点58分，星期五第30页，共47页，2022年，5月20日，1点58分，星期五1、差异杂交筛选（differentialhybridizationscreening）

2、mRNA差异显示(differentialdisplay)3、DNA表达文库（expressionlibrary）

4、DNA结合蛋白基因的分离

5、信号传递蛋白基因的分离

6、图位克隆技术（Map-basedcloning）第31页，共47页，2022年，5月20日，1点58分，星期五

酵母双杂交体系

酵母双杂交体系(yeast-twohybridsystem,Y2H)是上一世纪九十年代初期在转录因子结构基础上发展起来的一种敏感的检测蛋白质-蛋白质相互作用的方法，亦即是体内鉴定基因的方法。它不仅可有效地用来分离能与一种已知的靶蛋白(targetprotein)相互作用的另一种蛋白质及其编码基因，而且可以用来确定蛋白质相互作用的特异性结构域及其氨基酸序列。第32页，共47页，2022年，5月20日，1点58分，星期五方法构建两种E.coli-Yeast穿梭质粒载体:已知基因与BD序列融合表达融合的蛋白质叫做诱饵蛋白质(Baitprotein)第一种质粒载体又叫做诱饵质粒载体或DNA-BD质粒载体(具Trp基因)。第33页，共47页，2022年，5月20日，1点58分，星期五第二种质粒载体又叫做文库质粒载体或AD质粒载体，它具有亮氨酸基因(leu)，是用来构建cDNA表达文库的专用载体。cDNA编码蛋白质与GAL4-AD多肽融合这种与AD融合的蛋白质叫做基因文库编码蛋白质，其中可与诱饵蛋白质发生相互作用的特称为捕获蛋白质(preyprotein)第34页，共47页，2022年，5月20日，1点58分，星期五AD:GAL4ActivationDomain;DNA-BP:DNABindingProtein;USA：Upstreamactivatingsequence.GAL1UAS启动子LacZ(orHIS3)报告基因GAL1UAS启动子LacZ(orHIS3)报告基因GAL1UAS启动子LacZ(orHIS3)报告基因转录DNABDADDNABD(a)(b)(c)XYADXY第35页，共47页，2022年，5月20日，1点58分，星期五1、差异杂交筛选（differentialhybridizationscreening）

2、mRNA差异显示(differentialdisplay)3、DNA表达文库（expressionlibrary）

4、DNA结合蛋白基因的分离

5、信号传递蛋白基因的分离

6、图位克隆技术（Map-basedcloning）第36页，共47页，2022年，5月20日，1点58分，星期五图位克隆技术图位克隆(Map-basedcloning)又称定位克隆(positionalcloning),1986年首先由剑桥大学的Alancoulson提出，用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行的，无需预先知道基因的DNA顺序，也无需预先知道其表达产物的有关信息，但应有以下两方面的基本情况:一是有一个根据目的基因的有无建立起来的遗传分离群体。二是开展以下几项工作:1)首先找到与目标基因紧密连锁的分子标记；2)用遗传作图和物理作图将目标基因定位在染色体的特定位置；3)构建含有大插入片段的基因组文库(BAC库或YAC)；4)以与目标基因连锁的分子标记为探针筛选基因组文库；5)用获得阳性克隆构建目的基因区域的跨叠群；6)通过染色体步行、登陆或跳跃获得含有目标基因的大片段克隆；7)通过亚克隆获得含有目的基因的小片段克隆；8)通过遗传转化和功能互补验证最终确定目标基因的碱基序列。

第37页，共47页，2022年，5月20日，1点58分，星期五DNAmarkersforgeneticmaps●第38页，共47页，2022年，5月20日，1点58分，星期五eg.ThebreastcancergeneBRCA1MappingofBRCA1Toisolatethegene,thefirststepistodeterminewhichchromosomecontainsitandthepositionofthegeneonthischromosome.第39页，共47页，2022年，5月20日，1点58分，星期五第40页，共47页，2022年，5月20日，1点58分，星期五第41页，共47页，2022年，5月20日，1点58分，星期五图位克隆存在的问题图位克隆也有其自身的局限性，在某些情况下，就很难或者不能通过图位克隆技术来定位基因。

在分析自然发生的变异的时候，我们最有可能遇到的复杂情况是一个给定的性状是由不止一个的基因位点控制的。无论何时，当影响这些性状的自然或者诱导的突变被定位的时候，第二位点修饰成分会干扰这些分析。

表观（上位）遗传突变这个术语是描述一个基因在表达和功能上的可遗传改变，而不涉及DNA序列的改变，这是图位克隆工程中又一个可能的复杂情况。

关于染色体上位点的物理和遗传距离的比值是变化的。1%重组的遗传距离相当于100-400Kb的物理距离，平均是250Kb。然而着丝粒区域是一个显著的例外，在这里1%重组的遗传距