EPO工程细胞培养方法和反应器

EPO工程细胞大大规模培养养方法和反反应器马佳鹏刘刘丽佳佳70期生命科学学与技术基基地班沈阳药科大大学1红细胞生成成素(erythropoietin,EPO)红细胞生成成素(erythropoietin,EPO)是一种糖蛋蛋白,它是红细胞胞发育成熟熟过程中的的一种最重重要的调节节因子,它在治疗肾肾衰引起的的贫血中,显示明显的的疗效和很很小的副作作用;在纠正恶性性肿瘤相关关贫血、艾艾滋病引起起的贫血和和化疗引起起的贫血等等方面,也显示乐观观的前景;还可在手术术前作为自自体输血,从而避免感感染血源性性疾病等等等。因此EPO是很有前途途的一种细细胞因子2rhEPO的工程细胞胞rhEPO(人重组红细细胞生成素素)的工程细胞胞通常使用用CHO细胞,因为CHO细胞是重组组糖蛋白生生产的首选选体系,而rhEPO就是一种糖糖蛋白.CHO细胞是体壁壁依赖性细细胞.3培养基微载体生物反应器器rhEPOrhEPO工程细胞CHO培养参数分泌产物分离纯化4培养基天然培养基基合成培养基基无血清培养养基5无血清培养养基无血清培养养基是在合合成培养基基内加入不不同种类的的补充因子子而替代PBS的培养基.它避免了血血清培养基基污染的可可能性,并排除了批批次间的差差别还减少少了纯化的的难度.但无血清培培养基没有有广泛的适适应性,不同的细胞胞甚至不同同的细胞株株和细胞系系有各自独独立的无血血型培养基基配方.6补充因子是无血清培培养基中各各种血清替替代成分的的总称。补补充因子的的种类繁多多,主要有生物物大分子、、小分子和和微量元素素等。补充充因子又可可归类为必需补充因因子和特殊补充因因子。必需补充因子:胰岛素、转转铁蛋白和和亚硒酸钠钠所有的细胞胞株在无血血清培养基基中生长时时都需要的的,特殊补充因子:①生长因子②②激素③贴贴壁因子④④其它补充充因子71.胰岛素:细胞无血清清培养中,胰岛素的使使用浓度为为0.1~10μg··mL-1。胰岛素可可以促进RNA、蛋白质和和脂肪酸的的合成,抑制细胞凋凋亡,是重要的细细胞存活因因子,部分学者认认为在批式式培养中胰胰岛素迅速速耗尽是细细胞比生长长速率下降降的主要原原因。CHO细胞能在仅仅含重组人人胰岛素一一种蛋白成成分的无血血清培养基基中连续传传代82.转铁蛋白:大多数哺乳乳动物细胞胞上存在特特定的转铁铁蛋白受体体,受体与转铁铁蛋白/Fe3+复合物结合合是细胞获获取必需的的微量元素素铁的主要要来源,此外转铁蛋蛋白还具有有生长因子子的性质并并能与其他他微量元素素如钒等结结合。转铁铁蛋白的使使用浓度为为0.5~100μg·mL-1,亦有研究报报告指出,无血清培养养基中必须须要有转铁铁蛋白至少少5μg·mL-1,胰岛素才能能起作用。。也有资料料证实转铁铁蛋白在无无血清培养养基中的作作用可以为为某些铁盐盐所代替,如柠檬酸铁铁、二甲胂胂酸铁、葡葡糖酸铁等等。93.亚硒酸钠:Hewlett在1991年曾指出硒硒在任何一一种细胞,特别是人体体细胞的生生长过程中中确实具有有明显作用用,微量元素硒硒参与谷胱胱甘肽过氧氧化物酶和和过氧化物物歧化酶的的作用过程程,消除氧化物物酶和氧自自由基对细细胞的伤害害。亚硒酸酸钠的最适适添加浓度度是30~60nmol·L-1。10生产rhEPO的无血清培培养基用于基因重重组促人红红细胞生成成素(Recombinanthumanerythropoietin,rHuEPO)生产且不含含牛血清白白蛋白的无无血清培养养基-p(Serumfreemedium-p,SFM-p)培养液,就是在达尔尔贝可改良良的伊格尔尔(DulbeccosmodifiedEaglesmedium,DMEM)∶F12(1∶1)培养基中添添加了Se、乙醇胺、、多种维生生素、蛋白白胨、胰岛岛素、转铁铁蛋白和一一些细胞因因子等成分分构成的专专用培养基基11使用无血清清培养基的的问题无血清培养养基虽然在在各个方面面都显示出出其强大的的优势和发发展前景,但采用无血血清培养而而诱发的细细胞凋亡也也成为动物物细胞无血血清培养技技术中亟待待解决的问问题.在培养基中中加入某些些化合物,如金精三羧羧酸(Aurintricarboxylicacid,ATA)、锌离子、、抗氧化剂剂和细胞因因子等,在一定程度度上可阻止止因采用无无血清培养养基而导致的的细胞凋亡亡.12无血清培养养基展望培养基中所所添加的蛋蛋白成分主主要还是来来源于动物物或人,仍然存在病病毒污染的的危险,只有完全采采用非动物物来源的材材料,才是相对安安全的,而植物提取物物将是理想的的选择.可以这样预预测,未来开发的的新一代无无血清培养养基,将是一种既既无血清、、无蛋白,又可以高温温消毒,且适合于多多种不同细细胞生长的的全能型培培养基13微载载体体微载载体体培培养养是是细细胞胞在在由由葡葡聚聚糖糖制制成成的的小小球球表表面面成成单单层层生生长长,通过过轻轻轻轻搅搅拌拌使使细细胞胞维维持持悬悬浮浮状状态态。。这这种种培培养养较较传传统统的的单单层层细细胞胞培培养养,面积积大大大大增增加加,将这这种种微微载载体体在在流流化化床床式式、、固固定定床床式式反反应应器器中中进进行行培培养养,则可可获获得得比比原原来来多多20~50倍的的高高密密度度细细胞胞.14常用用的的微微载载体体15Cytodex微载载体体上上细细胞胞生生长长情情况况161718192021Cytopore的性性质质22动物物细细胞胞生生物物反反应应器器23常见见动动物物细细胞胞生生物物反反应应器器类类型型气升式(airlift)生物反应器中空纤维管(hollow-fiber)生物反应器流化床(fluidiz-bed)生物反应器(FBR)搅拌罐(stir-tank)生物反应器(STR)固定床(fixed-bed)生物反应器填充床(packed-bed)生物反应器24填充床生物反反应器动物细胞大规规模培养需要要合适的生物物反应器.目前国内用的的比较多的适适合CHO细胞生长并能能高效表达产产物的反应器器是填充床式式生物反应器器,其中比较有名名的是美国NBS公司生产的Celligen系列.25CelligenplusCelligen31026Cellgen系列生物反应应器的特点适合贴壁培养养细胞和悬浮浮细胞,适合各种动物物细胞,昆虫细胞和植植物细胞等灌流式的培养养过程低（无）剪切切力搅拌,无气泡通气；；特殊的贴壁载载体,比表面积大,静止培养通过持续检测测摄氧率实时时检测细胞浓浓度符合现行药品品生产质量管管理规范(cGMP)27灌注培养灌注属于连续续培养,细胞保留在反反应器系统中中,收获培养液的的同时不断加加入新鲜培养养基.灌注培养的主要优点是连续灌注的的培养基可以以提供充分的的营养成分,并带走代谢产产物.同时,细胞保留在反反应器中,可以达到很高高的细胞密度度.同其他方法相相比,灌注培养的产产率可以提高高一个数量级级,并可以大大降降低劳动力的的消耗.2829Celligen系列生物反应应器的特点适合贴壁培养养细胞和悬浮浮细胞,适合各种动物物细胞,昆虫细胞和植植物细胞等灌流式的培养养过程低（无）剪切切力搅拌,无气泡通气；；特殊的贴壁载载体,比表面积大,静止培养通过持续检测测摄氧率实时时检测细胞浓浓度符合现行药品品生产质量管管理规范(cGMP)30搅拌叶轮种类类31Celligen系列生物反应应器的特点适合贴壁培养养细胞和悬浮浮细胞,适合各种动物物细胞,昆虫细胞和植植物细胞等灌流式的培养养过程低（无）剪切切力搅拌,无气泡通气；；特殊的贴壁载载体,比表面积大,静止培养通过持续检测测摄氧率实时时检测细胞浓浓度符合现行药品品生产质量管管理规范(cGMP)32Celligen系列使用的载载体—Fibra-Cel(聚酯片)33FibraCel的技术指标34FibraCel的电镜照片无细胞生长的的FibraCelHEK293细胞在FibraCel上生长4天的情况HEK293细胞在FibraCel上生长7天的情况35FibraCel适用的细胞种种类36篮式纤维填充充床37Celligen系列生物反应应器工作原理理(P113)38用无血血清培培养基基在填填充床床生物物反应应器生生产rHuEPO文摘在填充充床生生物反反应器器用含含5%FBS的DMEM:F12培养基基培养养产重重组人人促红红细胞胞生成成素(rHuEPO)的细胞胞CHO8~10d后,使用自自制的的无血血清生生产培培养(SFM-p)生rHuEPO。SFM-p培养基基既能能维持持细胞胞生长长,又能生生产EPO,也便于于纯化化分离离rHuEPO。使用用填充充床生生物反反应器器培养养细胞胞,能维持持培养养20~25d,rHuEPO表达水水平达达12~28·4mg/L之间,反应器器的产产率达达71··0mg/L/d,比滚瓶瓶的产产率增增加12~14倍。葡葡萄糖糖最高高消耗耗量达达到21g/L/d,细胞培培养密密度最最高达达到3·0×107/ml以上,每次可可收无无血清清培养养上清清80~87L。由于于细胞胞被固固定在在聚酯酯片上上,培养上上清中中脱落落细胞胞很少少。观观察了了反应应器的的乳