卫生微生物卫生微生物研究和检测的方法

卫生微生物学第三章卫生微生物研究和检测的方法第一节卫生微生物检测的特点及基本原则第三节卫生指示微生物第二节卫生微生物研究和检测的方法第四节卫生微生物研究和检测方法的前景第一节卫生微生物检测的特点及基本原则

一、卫生微生物检测的特点1．检测的对象多病原微生物+非致病和条件致病微生物特别是能反映环境、食品、健康相关产品等样品卫生质量的卫生指示微生物。2．检测的范围广标本的来源不仅局限于人体，也来源于空气、水、食品等环境。3．检测的方法必须更敏感以检测环境标本中数量很低的致病微生物。4．定量测定和分型检测以探明感染性疾病的传染源、传播途径、流行情况等。二、卫生微生物检测基本原则（一）样品的采样原则代表性/针对性与及时性（常规的监测与评价/突发事件探因）防污染（不能引入新污染）防杀菌/保护目的微生物（抑菌物质的存在降低检出率）细标记1.采样的代表性与针对性（1）影响采样代表性的因素包括:采样量采样部位采样时间采样的随机性和均匀性以及按批号抽样注意样品种类

5eg:

GB4789.1－2010中食品安全标准采样方案（2）二级采样方案&三级采样方案关键词:n,同一批产品应采的样品件数m,可接受的微生物指标限量标准c,最大容许超过m值的样品数M，微生物指标的最高安全限量值。67

2.采样的其他原则避免采样时外界微生物对样品的新污染：所有采样用具、容器需严格灭菌，并以无菌操作采样。避免采样时对微生物的杀灭作用和引入新的抑菌物质：如容器是否有消毒剂的残留，或使用刚烧灼未冷却的采样工具。保护目的微生物：使用正确的采样液或加入中和物质。注意对样品的详细标记：样品名称、编号、采样时间、采样者、检测项目。（二）样品的运送原则

1.尽快送检采集的样品，应在规定的时间内（一般不超过3~4小时）送到实验室，尽快送检。一方面可减少待测微生物的死亡。另一方面可防止微生物的繁殖对计数结果的影响温度调节淋病奈瑟球菌防冻死加入保护剂

用于分离病毒的样品50%甘油缓冲液或由0.5%的水解蛋白+2%小牛血

清+2(或3）抗；

鼠疫杆菌及其他G-可用卡-布半固体（0.067M磷缓处理过的棉笺）；

厌氧菌专用的运用培养基去除其他不利于待测微生物生存的因素

血清检测注意防溶血2.保护待检微生物3.生物安全防人员感染：个人防护（？）防标本和环境的污染：无菌操作、恰当处理污染废弃物4.遵循完善的样品交接制度送往实验室的样品，必须附有样品送检单，实验室收到样品应按送检单逐项核对，检查样品是否符合检验要求，确证无误方可签收待检。（三）实验室检验原则相应的硬件条件和设备具有合格的检验人员和采用标准或公认的方法实验室质量控制根据卫生检验的特点采取特殊措施1.实验环境要求的一般原则实验室环境不应影响检验结果的准确性工作区与办公区分开工作面积应满足检验工作的需要温度、湿度、照度、噪声和洁净度等应符合工作要求整体布局应采用单方向工作流程，避免交叉污染一般样品检验：洁净区（超净工作台或洁净实验室）病原微生物分离鉴定：BSL-2

应有检测不同病原菌相应的条件和设备微生物按其是否致病、致病力强弱、危害人体的严重性、传染性的大小、当地人群的免疫水平、有无免疫制剂和特效治疗药物等可分成不同的危害等级。在不同生物安全级别实验室进行

2.具有合格的检验人员和采用标准或公认的方法

（1）必须经常接受专业技术培训，掌握检验项目的基本原理及技术方法

技术质量考核：可用几种基本技术作考核评价的指标。①细菌计数：可使用分散性和稳定性好的枯草菌CMCC（B）63501株制作芽孢悬液。请几名被试人员用直径9cm~10cm的普通营养琼脂平板，作表面涂沫接种计数，重复作5次，求平均数和标准差，以标准差小，和显微镜直接计数折算值接近的为佳。②生化试验重现性：用铜绿色假单胞菌CMCC（B）1012株，注意结果的重现性。③模拟样品检出考核：选合适的基质如奶粉，加入指标菌，如普通变形杆菌CMCC（B）49001株。考核前先作预备试验。指定检验方法，确定检出最小菌数。然后用最小菌数的5倍量、10倍量加入模拟基质中，进行检出试验，从盲检结果的正误进行评定。

（2）采用标准/公认的检验方法进行检测凡有国家标准、部颁标准或行业检查方法的均按标准方法检验。没有国家或部颁标准，按上级疾病预防控制中心的要求，参照共同协定的方法检验。3.加强实验室质量控制仪器设备的质控：

培养基、试剂的质量控制：消毒灭菌效果的控制：建立良好的实验记录制度：

建立良好的核查、校对制度报告与核查制度

报告结果的层次、时限；突发公共卫生事件可分初步报告和确诊报告两个层次。4.根据卫生检验的特点采取特殊措施做好应对突发事件的准备如果一个样品需做多种分析，检测微生物优先样品处理：均质化、乳化后再行稀释；抑菌物质去除；目的菌浓缩

(样品的处理策略（目的）与方法)微生物的复苏

第二节卫生微生物研究和检测的方法

卫生微生物样品特点：

目的菌数量低

细菌受损

杂菌多数量低——浓缩细菌受损——复苏杂菌多——选择性增菌和分离

一、样品处理（一）样品混匀：液体样品常通过电动、手摇或敲打震荡，使之混匀；固体样品需通过置灭菌乳钵内研磨均匀，或于高速组织捣碎机或匀浆器中在少量液体存在下，捣碎混匀后再取样，或使用商品化的均质器混合待检样品。

（二）样品浓缩常用的样品浓缩方式有沉淀法过滤法吸附法免疫磁珠法1.沉淀法：细菌可通过普通离心机离心沉淀而浓缩，或者通过差速离心，去除杂质，收集菌体，达到浓缩的目的。病毒浓缩需采用高速或超速离心机。2.过滤法：是将样品在负压或正压作用下，通过孔径为0.45μm的滤膜，细菌被阻留在膜上，而达到浓缩的目的。样品中的病毒可通过膜的静电吸附浓缩。过滤法不但可浓缩微生物，还可消除样品中的抑制剂对后续培养的影响。2022/10/25裴晓方xxpei@253.吸附沉淀法：可分为特异性和非特异性吸附两类。非特异性吸附如利用加入化学制剂，形成沉淀，细菌被共沉淀的方法；而特异性吸附则是利用配体与受体的亲和力，吸附待检微生物，如为浓缩检样中的流感病毒，利用该病毒具有血凝素，可与红细胞结合的特点，将检品中加入红细胞吸附病毒，低速离心收集红细胞，而达到浓缩病毒的目的。4.免疫磁珠法免疫磁珠法(MACS)：免疫磁珠法是2O世纪80年代出现的技术方法。1983年Ugelstad提出将免疫磁珠用于细胞分选，1990年，Mihenyi建立了MACS。这一方法的核心是在磁珠表面包被具免疫反应性的抗体进行抗原抗体反应特异性结合，或者已包被二抗(羊抗小鼠或羊抗大鼠)的磁珠与预先已与细胞表面分子特异结合的一抗结合。磁珠携带与之结合的细胞吸附于分离柱/试管上，实现阳性细胞分离或阴性细胞的分离。二、损伤菌的复苏环境样品中的微生物，因经受冷、热、脱水干燥、辐照、高渗透压或消毒剂的作用，可能引起亚致死性损伤，受损伤的微生物用一般的培养方法不易培养，需预先进行复苏（resuscitation）或修复（repair）后，才能进行常规的检测。修复的基本方法是在细菌繁殖之前，将其置于无选择性压力的培养环境中，一般降低培养温度培养一定时间后，再进行常规检验。三、选择性增菌与分离（一）物理方法：主要通过调节培养的温度、气体条件和光照，进行选择性增菌与分离的方法。（二）化学方法：利用目的微生物的特定生理功能在分离培养基中加入抑制其他微生物生长和显示目的微生物的化学制剂，配制成选择性鉴别培养基，达到对目的微生物增菌分离的目的。

四、定量计数方法（一）倾注平板计数法（二）表面涂布计数法（三）MPN法：即最可能数法(mostprobablenumber,MPN)（四）其它方法：包括显微镜直接计数法、比浊计数法、微菌落快速计数法、生化方法间接推算微生物量，以及半定量法（semi-quantitativemethod）等。标准平板计数法表面涂布法不透明培养基-+菌落生长处琼脂表面+琼脂内琼脂表面加样量1ml0.1ml样分散方式混匀涂布

（一）&（二）平板计数法35表面涂布法（SpatulaMethod）倾注平板计数法表面涂布法做平板菌落计数时，可用肉眼观查，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平板的菌落数后，求出同稀释度的各平板平均菌落总数。典型菌落：紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5mm或更大大肠菌群在结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）上的生长情况（三）最可能数法（most

probable

number,

MPN）当需要对样品中的某种细菌进行选择性计数时，由于样品中混有其他杂菌，无法采用平板菌落计数的方法进行计数，在这种情况下可用MPN法计数菌落，特别是对菌落数少的样品进行选择性计数有好处，因为倾注平板法和表面涂布法的样品量偏少。最常用的MPN法是用多管法对水和食品中的大肠菌群进行计数，也可用于粪大肠菌群和产气荚膜梭菌等的计数。MPN法的精髓表述是“多次稀释直至无菌”（multiple

dilution

to

extinction）。（四）其他计数方法举例显微计数法比浊计数法微菌落快速计数法准备PetrifilmTM测试片接种1ml样本液缓慢盖上上层膜用压板轻压培养基样本接种结果红色有气泡的菌落确认为大肠菌群（四）其他计数方法举例GB/T4789.3-2008新增大肠菌群PetrifilmTM测试片法大肠杆菌PetrifilmTM测试片计数法与大肠菌群PetrifilmTM测试片计数法方法一致结果判读大肠杆菌大肠菌群蓝色带气泡的菌落红色带气泡的菌落五、分型鉴定的方法噬菌体分型细菌素分型耐药谱分型血清学分型质粒图谱分型毒素分型脉冲肠凝胶电泳分型（PulseNet）其他方法微生物鉴定系统免疫核酸杂交PCRG+C含量基因芯片蛋白质芯片第三节指示微生物

indicatormicroorganism是在常规卫生监测中，用以指示样品卫生状况及安全性的（非致病）微生物（或细菌）。为什么常常通过检测指示微生物反映样品卫生安全性？

①致病微生物种类多，检测方法各异，对样品的卫生安全性作出评价时，不可能分别检测各种微生物；②致病微生物的数量少，而检测方法的灵敏度不高；或者受到检测量的限制，可能导致假阴性结果③分离、鉴定致病微生物需时长，不能满足实际工作的需要④分离、鉴定致病微生物费用高，而且对人员的技术要求也相对较高选择指示微生物的总原则数量大易于检出检验方法简单、经济、方便有一定的代表性，其数量变化能反映样品卫生状况及安全性

四种类型

①菌落总数（细菌、霉菌和酵母菌数）②粪便污染指示菌（大肠菌群、粪链球菌、产气荚膜梭菌）③其它指示菌：特定菌、某些致病菌

与人类健康密切的样品，如直接进口的食品、饮用水，除检测卫生指示微生物外，还要求直接检测某些致病菌如：沙门菌、志贺菌、金黄色葡萄球菌④病毒（包括噬菌体）

一、常用的指示微生物

（一）菌落总数AerobicPlateCount概念：菌落总数是指被检样品的单位重量(g)、容积(ml)、表面积(cm2)或体积(m3)内，所含有的能在某种培养基上经一定条件、一定时间培养后长出的菌落数量。以菌落形成单位数（colonyformingunit，cfu）表示。种类：菌落总数包括细菌菌落总数、霉菌菌落总数和酵母菌菌落总数。

细菌菌落总数：平板计数琼脂（而非原来的营养琼脂）

霉菌和酵母：传统的孟加拉红琼脂（可用马玲薯琼脂）卫生学意义：用于判定检样被微生物污染的程度或动态观察，也是某些样品的卫生限量标准。测定方法：常用标准平板计数法(standardplate-countingmethod)和表面涂布法（SpatulaMethod

）

（二）粪便污染指示菌①大量存在于人及温血动物肠道，未被粪便污染的样品中无此种菌存在；②在外环境中的抵抗力，包括对消毒剂的抵抗力与肠道致病菌大致相似或稍强；③在外环境中不繁殖，存活时间与肠道致病菌大致相似或稍长；④样品有无受粪便污染，检出结果差异显著；⑤用于水卫生指标时，对水处理剂的抵抗力不低或略强于肠道致病菌；⑥检验方法简便，易于定量计数。1.大肠菌群（coliformgroup）：是一群能在35~37C、24小时内发酵乳糖产酸产气的、需氧或兼性厌氧的、革兰阴性的无芽胞杆菌。是存在于人和温血动物肠道中的一大群菌。卫生微生物检验中最重要的指示微生物大肠菌群指示粪便污染主要包括：四个属的菌埃希氏菌属(Escherichae)克雷伯氏菌属(Klebsiella)肠杆菌属(Enterobacter)枸橼酸杆菌属（Citrobacter）根据生长温度的差异，将能在35～37C生长的称为总大肠菌群，而在44～45C仍能生长的大肠菌群称为耐热大肠菌群(thermo-tolerantcoliformgroup)或粪大肠菌群（faecalcoliformFc），耐热大肠菌群的主要成员是埃希氏菌属（总组成基本同于总大肠菌群，但其他3属所占比例甚少）。2.大肠埃希菌（Escherichae

coli）普遍存在于人和动物的肠道内（新鲜粪便中每克可达109CFU），近年来随着测定新方法的发现和建立，大肠埃希菌作为粪便污染的指示菌的应用越来越多。利用大肠埃希菌产生的葡萄糖苷酸酶，分解吲哚葡萄糖苷酸，产生有色物质，而使菌落显色，对大肠埃希菌数进行测定。总大肠菌群&大肠埃希菌的卫生学意义大肠菌群在粪便污染检出中的意义及缺陷；作为粪便污染的指示菌，大肠埃希菌检出的意义最大，其次是耐热大肠菌群，总大肠菌群的检出意义略差一些。大肠菌群的测定方法类型最可能数法（泊松分布，概率）三步法（初发酵-假定阳性实验、分离培养-G染色、证实实验）

两步法，2008年食品卫生微生物及2010年食品安全GB（假定实验=初发酵-月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤LST；证实实验=复发酵实验-煌绿乳糖胆盐肉汤BGLB）。平板计数法滤膜法测试片法（纸片法）大肠菌群的可能数指100g(或100ml)检样内所含大肠菌群的最可能数(MPN)。有时为了更确切地反映粪便污染，用粪大肠菌群作指标。是指在44土0.5℃培养24h能分解乳糖产酸产气、在蛋白陈水中生长产生靛基质的、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌（主要是指大肠杆菌）。大肠杆菌MPN计数初发酵复发酵伊红美蓝平板分离培养营养琼脂斜面或平板培养生化试验GB/T4789.3-2010大肠菌群MPN计数初发酵复发酵3.粪链球菌（fecalStreptococcus，Fs）

（1）肠球菌属（Enterococcus），人畜肠道中的正常菌群，数量较高，但低于大肠杆菌一个数量级；

（2）粪链球菌在动物粪便中所占比例较高，比值大于4.1，人，小于4.1，动物；对酸碱冷热及含氯消毒剂的抵抗力大于大肠菌群，但在适宜条件水体中的繁殖力却又低于后者；

（3）测定方法可