液相色谱培训讲义

液相色谱培培训讲义义(十))x

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发布布日期：：20007-55-222第十一章柱子的的应用与与维护色色谱柱的的液相色色谱系统统获得分分离的中中心部件件，许多多分离问问题都归归结于色色谱柱。对对柱注意意适当的的维护，则则可缓解解许多故故障的发发生。柱柱故障主主要是由由机械、色色谱或者者化学方方面的原原因引起起的。维维护色谱谱柱和排排除故障障，；需需要懂得得液相色色谱的分分离过程程以及色色谱柱本本身的构构造是非非常重要要的。色色谱柱的的价格昂昂贵，应应避免人人为地损损坏，并并尽可能能延长其其寿命。一、色谱柱柱的种类类与评价价一一般地说说，根据据样品的的性质决决定采用用何种液液相色谱谱方法，然然后再选选择不同同类型的的柱。即即不同类类型的柱柱则代表表了不同同的色谱谱方法。不不同种类类色谱柱柱的差异异在于柱柱结构、柱柱填料和和柱尺寸寸的不同同。色色谱柱有有不同的的尺寸((长度和和内径))，分制制备型、常常规分析析型和微微型。不不同类型型柱的硬硬件也不不同，((包括接接头、柱柱管等方方面)，还还有径向向加压柱柱和夹套套加热柱柱等。不不同液相相色谱法法的尺寸寸根据需需要可以以选取，普普通分析析3～330cmm长，内内径4～～8mmm。常用用20ccm长、44.6mmm内径径的柱。制制备型柱柱内径一一般为88mm、225cmm长。微微型柱内内径l～～3mmm，长110～220cmm。不同同的填料料分析的的效果可可能不同同，这是是因为生生产过程程不同所所致。同同一厂商商生产的的同种填填料因批批号不同同也会有有差异，这这种差异异可能从从基质就就开始((表面积积、杂质质、特殊殊处理))，还有有键合的的化学物物质(一一氯或三三氯硅烷烷反应剂剂)，不不同厂家家生产的的填料还还会因专专利技术术(预处处理、键键合过程程、填装装技术))等不同同而呈现现较大差差异。由由于种种种差异、仅仅能假设设同一批批号的柱柱有基本本相同的的性质。多多数柱填填料基质质采用多多孔硅胶胶微粒，通通常有球球形和无无定形两两种，具具有不同同的粒度度、孔径径和表面面积。多多孔聚合合物微粒粒也适用用于反相相色谱。聚聚合物柱柱的流动动相范围围广，流流动相ppH值可可在1至至一三之之间。而而硅胶基基质pHH仅能在在2.55和7之之间。显显然，聚聚合物柱柱要好一一些，但但目前仍仍是以硅硅胶基质质的柱为为主。原原则上，聚聚合物柱柱可以克克服硅胶胶基质柱柱的某些些不足，但但需要大大量的实实验来证证实，要要进一步步考查聚聚合物基基质填料料的全面面优越性性。在在实际工工作中，选选择性能能良好的的柱可得得到好的的结果，首首先要注注意柱径径、长度度、填料料种类和和填料粒粒度。评评价柱的的好坏不不仅只是是N数，还还应考虑虑组分在在柱上的的保留、键键合相表表面的物物性、柱柱压降以以及峰不不对称因因子Ass等。每每一根新新柱都应应标出详详细参数数，主要要内容包包括公司司名称、柱柱名称((商标))、柱填填料、尺尺寸。附附一张标标准参考考色谱图图，并标标出色谱谱条件、样样品名称称、流动动相组成成、流速速、柱温温、进样样体积、检检测器、峰峰的保留留时间及及峰名称称等。评评价一根根色谱柱柱的主要要指标是是：①塔板数数N值；；②峰不对对称因子子As；；③柱压降降；④键合相相浓度。二、色谱柱柱预防性性保护与与柱寿命命的延长长通通常，一一根色谱谱柱在分分析数千千个样品品之后性性能仍然然保持良良好，但但也有的的柱仅分分析不多多的样品品后几乎乎就报废废了。影影响柱寿寿命和其其它问题题的因素素很多，而而有些因因素是操操作者很很难控制制的，如如果被分分析的样样品(如如分析生生物样品品)，怎怎么净化化样品也也是“脏”的，对对于色谱谱柱的影影响是非非常大的的。然而而采取下下列措施施后，在在多数情情况下总总能够人人为地减减少柱上上故障，达达到延长长寿命的的目的。1、加流路路过滤器器和保护护柱流流路过滤滤器紧靠靠进样阀阀后面，位位于分析析柱前。00.5μμm烧结结不锈钢钢片夹在在死体积积很小的的套子中中，挡住住来源于于样品和和进样阀阀垫圈的的微粒入入柱。因因为每个个样品都都过滤既既费事又又带来误误差，样样品量少少过滤更更困难，因因此流路路上装过过滤器是是比较省省事的办办法。也也可以在在流路加加上保护护柱，放放在流路路过滤器器和分析析柱之间间，或者者代替流流路过滤滤器。保保护柱的的使命是是收集阻阻塞柱进进口的来来自样品品的化学学“垃圾”。这种种垃圾最最终降低低柱效能能。保护护柱是消消耗品，分分析500～1000个比比较脏的的样品之之后就要要调换新新的。保保护柱应应该是小小体积，用用分析柱柱的同种种填料填填装。保保护柱使使用得当当，对分分离无影影响，好好像未装装保护柱柱一样。有有些厂商商的商品品将保护护柱和流流路过滤滤器连在在一个单单元内，使使用起来来非常方方便。自自己填装装保护柱柱都是用用短柱、不不超过33cm长长，内径径2～33mm，用用较大粒粒度的填填粒(一一五～220μm)干干法填装装，会使使分析柱柱效略微微有所降降低。2、避免高高压冲击击一一般色谱谱柱都能能经得起起高压，但但经不起起突然变变化的高高压冲击击。引起起高压突突然冲击击，主要要是因样样品阀的的缓慢转转动、泵泵起动快快、柱切切换操作作等。转转动六通通进样阀阀时从泵泵到柱的的液流会会瞬时切切断。在在阀的泵泵侧压力力升高，在在阀的柱柱侧压力力降低((变化超超过200％)。阀阀转到底底后压力力突然冲冲击一下下恢复正正常。手手动进样样阀的变变化不大大，自动动进样阀阀比较慢慢，可能能造成压压力冲击击，可用用氦气代代替空气气驱动进进样阀。因因氮压缩缩系数小小。另外外泵起动动不应过过快，可可分步操操作。如如用3mmL／mmin流流速，先先从lmmL／mmin到到2mLL／miin，然然后再33mL／／minn，每个个间隔应应大于220s。柱柱切换技技术的应应用也很很广泛，切切换过程程中在色色谱柱的的入口处处压力在在零到很很大数字字之间变变化，会会很快使使柱报废废。3、分离条条件多多数色谱谱柱有很很宽的试试验条件件范围，但但具体应应用又受受到限制制，主要要是pHH值、柱柱温和流流动相的的选择。硅硅胶为基基质的键键合相要要求PHH在2..5～77之间，极极端pHH的流动动相能“溶解”硅胶，使使键合相相流失。结结果非碱碱性组分分的保留留不断减减少，碱碱性组分分的保留留增加，引引起碱性性组分峰峰变宽。如如果一定定要用高高或低ppH的流流动相，可可加预柱柱(饱和和柱)。预预柱装在在泵和进进样阀之之间，用用分析柱柱相同的的填料填填装，或或者用普普通硅胶胶。硅胶胶饱和了了流动相相，减少少了分析析柱填料料的损失失。预柱柱不要求求柱效高高，用价价格低的的一般硅硅胶疏松松地填装装，按期期检查硅硅胶的溶溶解情况况。用预预柱也有有不利的的影响，即即新流动动相难以以平衡，保保留时间间不稳定定或稳定定慢。使使用了预预柱一定定要加流流路过滤滤器，以以防止硅硅胶微粒粒引起的的麻烦。以以硅胶为为基质的的柱和阴阴离子交交换柱超超过600℃后，会会增加对对流动相相中化学学物质的的吸附。在在高温下下用小颗颗粒柱引引起柱床床塌陷，降降低柱效效，改变变峰形。在在40℃℃以上使使用3μμm柱，770℃以上使使用5μμm柱，会会使值降降低500％。有有些流动动相中的的溶剂不不能用于于某些柱柱，如小小颗粒的的聚苯乙乙烯填料料不能用用于非水水的排阻阻色谱。另另一方面面，有些些柱与某某些溶剂剂(如四四氢呋喃喃)一旦旦达到平平衡，不不要随意意改用其其它溶剂剂。有关关这些特特殊填料料，可以以参见有有关资料料。水水溶性流流动相会会引起微微生物生生长而造造成阻塞塞柱。色色谱柱应应存放在在纯有机机溶剂或或加了550％有有机溶剂剂的水中中。凝胶胶柱可存存放在水水溶性缓缓冲液中中，同时时加0..01％％叠氮钠钠以防止止微生物物的生长长。4、净化样样品用用溶剂溶溶解的样样品，多多数组分分在一定定的时间间内能完完全从柱柱中流出出来，不不会造成成危害。有有些样品品可能含含有微粒粒物质，样样品中的的某种组组分(如如蛋白质质)在柱柱头上沉沉积下来来，组分分在固定定相上保保留很强强，溶剂剂带走柱柱填料等等，这些些都会造造成柱效效能下降降或对柱柱寿命的的影响，有有必要采采取措施施防止柱柱变坏。如如在光线线照射下下观察样样品是浑浑浊的或或带有乳乳白色，进进样前必必须要过过滤．虽虽然流路路上装有有过滤器器和保护护柱，但但不能代代替样品品的前处处理，样样品中过过多的微微粒会使使过滤器器和保护护柱超载载，很快快阻塞，或或者微粒粒进入分分析柱，所所以在进进样前必必须过滤滤样品。若若怀疑样样品与流流动相混混合有沉沉淀而对对色谱柱柱有阻塞塞，应先先试验一一下，看看样品溶溶液加入入流动相相中有无无变浑或或乳白色色出现。如如果进样样后压力力突然增增加而后后又慢慢慢减小，表表明样品品中有微微粒或发发生沉淀淀。如有有沉淀要要设法改改变分离离条件，包包括换样样品溶剂剂和流动动相或处处理样品品去掉不不溶物质质。应尽尽量用小小体积的的样品。有有些样品品能很强强地吸附附在柱填填料上，这这样会降降低塔板板数，改改变样品品的保留留物质外外，还要要加保护护柱，定定期清洗洗色谱柱柱。有时时因为疏疏忽，用用对柱有有害的溶溶剂溶解解样品，比比如用66moll／L的的氢氧化化钠溶解解样品，这这样的样样品只要要进500～1000μL到硅硅胶基质质柱中，硅硅胶就很很快溶解解而使柱柱报废。在在这种情情况下，应应立即中中和样品品，或除除去原溶溶剂中的的有害成成分。5、用强溶溶剂定期期冲洗柱柱每每次工作作结束，用用强溶剂剂冲洗柱柱是良好好的习惯惯。可用用甲醇、乙乙腈冲反反相柱，冲冲去留在在柱上的的强吸附附组分。用用甲醇水水为流动动相时也也应冲洗洗。冲洗洗的程序序在以下下章节中中介绍。柱柱头的烧烧结不锈锈钢滤片片，要求求平整，死死体积小小，孔径径适当((2～55μm)。过过滤片选选择不好好会改变变色谱峰峰形，增增加阻力力或起不不到阻挡挡污染物物的作用用(填料料很快变变色)。此此外，对对柱硬件件的保养养也不可可忽视．．实际操操作中应应注意以以下几点点：①接头要要配套，用用同一厂厂商的组组接件；；②接头之之间、柱柱压帽螺螺母与密密封卡套套之间无无微粒((填料))，否则则收紧时时容易咬咬死；③③密封卡卡套与柱柱管一次次性卡紧紧后再也也不能松松动，所所以拆开开柱头再再上紧时时要小心心，不能能使卡套套移动，原原来柱端端的不锈锈钢滤片片和垫片片的厚度度和强度度也不能能改变((改变这这些附件件的性能能就促使使卡套移移动；④④接头等等组接件件不要拧拧得过紧紧，适当当上紧后后接上泵泵试验，分分步拧紧紧，直到到不漏为为止．还还有非常常重要的的是柱硬硬件的损损坏往往往会造成成不可挽挽回的损损失。综上所述，如如何保护护良好的的柱性能能与柱寿寿命：O认真阅读读色谱柱柱使用说说明书；；O使用填充充良好的的色谱柱柱；O尽量减少少压力波波动，避避免机械械及热冲冲击；O使用保护护柱及在在线过滤滤器；O经常以强强溶剂冲冲洗色谱谱柱；O充分过滤滤样品及及流动相相，尽量量避免杂杂质微粒粒与强保保留成分分；O用稳定的的固定相相(C一一八最稳稳定)：：O在中等ppH值操操作时((6～88)，用用有机缓缓冲溶液液；O色谱柱使使用温度度最好小小于400℃；O硅胶基质质的色谱谱柱，应应保持流流动相的的pH值值范围在在3.00～8..0；O在水流动动相与缓缓冲溶液液中加2200pppm的的叠氮钠钠；O流动相中中含有缓缓冲溶液液，应注注意用995：55的水及及有机溶溶剂过滤滤，有机机溶剂不不能低于于5％；；O过夜或贮贮存时，冲冲洗掉盐盐和缓冲冲液，用用纯有机机溶剂流流动相保保存(乙乙腈最好好)。三、怎样选选择色谱谱柱现现代高效效液相色色谱中，分分离效果果好坏很很大程度度上取决决于色谱谱填料的的选择。但但是色谱谱填料的的选择范范围很宽宽，要做做合适的的选择，必必须对此此有一定定的认识识和了解解。1.硅胶基基质填料料（1）正相相色谱正正相色谱谱用的固固定相通通常为硅硅胶(SSiliica))以及及其他具具有极性性官能团团，如胺胺基团((NH22APSS)和氰氰基团((CN,,CPSS)的键键合相填填料。由于硅胶表表面的硅硅羟基((SiOOH)或或其他极极性基团团极性较较强，因因此，分分离的次次序是依依据样品品中各组组份的极极性大小小，即极极性较弱弱的组份份最先被被冲洗出出色谱柱柱。正正相色谱谱使用的的流动相相极性相相对比固固定相低低，如如：正己己烷(HHexaane))、氯仿仿(Chhlorrofoorm))、二氯氯甲烷((MetthylleneeChhlorridee)等。（2）反相相色谱反相色谱用用的填料料常是以以硅胶为为基质表表面键合合有极性性相对较较弱的官官能团的的键合相相。反相色谱所所使用的的流动相相极性较较强，通通常为水水、缓冲冲液与甲甲醇、乙乙腈等的的混合物物。样品流出色色谱的顺顺序是极极性较强强的组份份最先被被冲洗出出，而极极性弱的的组份会会在色谱谱柱上有有更强的的保留。常用的反相相填料有有：C一一八(OODS))、C88(MOOS)、CC4(buutyll)、CC6H5(Phhenyyl)等等。2.聚合物物填料聚合物填料料多为聚聚苯乙烯烯-二乙乙烯基苯苯或聚甲甲基丙烯烯酸酯等等，其主主要优点点是在ppH值为为1~114均可可使用。相对于硅胶胶基质的的C一八八填料，这这类填料料具有更更强的疏疏水性；；大孔的的聚合物物填料对对蛋白质质等样品品的分离离非常有有效。现现有的聚聚合物填填料的缺缺点是相相对硅胶胶基质填填料，色色谱柱柱柱效较低低。3.其它无无机填料料其其它HPPLC的的无机填填料色谱谱柱也已已经商品品化。由由于其特特殊的性性质，一一般仅限限于特殊殊的用途途。如，石石墨化碳碳正逐渐渐成为反反相色谱谱柱填料料。这种种填料的的分离不不同于硅硅胶基质质烷基键键合相，石石墨化碳碳的表面面即是保保留的基基础，不不再需其其它的表表面改性性。该柱柱填料一一般比烷烷基键合合硅胶或或多孔聚聚合物填填料的保保留能力力更强。石石墨化碳碳可用于于分离某某些几何何异构体体，又由由于在HHPLCC流动相相中不会会被溶解解，这类类柱可在在任何ppH与温温度下使使用。氧氧化铝也也用于HHPLCC，氧化化铝微粒粒刚性强强，可制制成稳定定色谱柱柱柱床，其其优点是是可在ppH高达达12的的流动相相中使用用。但由由于氧化化铝与碱碱性化合合物作用用也很强强，应用用范围受受到一定定的限制制，所以以未能广广泛应用用。新型型氧化锆锆基质色色谱填料料也可用用于HPPLC，商商品化的的仅有聚聚合物涂涂层的多多孔氧化化锆微球球色谱柱柱，应用用pH范范围1~~14，温温度可达达1000℃。由于于氧化铝铝填料是是最近几几年才开开始研究究，加之之面临的的实验难难度，其其重要用用途与优优势尚在在进行中中。四、怎样选选择填料料粒度目目前，商商品化的的色谱填填料粒度度从1μμm到超超过300μm均有有售，而而目前分分析分离离主要用用3、55和100μm填料料，填料料的粒度度主要影影响填充充柱的两两个参数数，即柱柱效和背背压。粒粒度越小小，填充充柱的柱柱效越高高；然而而粒度越越小，柱柱压越大大，柱压压的增加加限制了了粒度小小于3μμm的填填料应用用。在相相同选择择性条件件下，提提高柱效效可提高高分离度度，但不不是唯一一的因素素。如果果固定相相选择是是正确，但但是分离离度不够够，那么么选用更更小粒度度的填料料是很有有用的。33μm填料料填充柱柱的柱效效比相同同条件下下的5μμm填料料的的柱柱效提高高近300％；然然而，33μm的色色谱柱的的背压却却是5μμm的22倍。与与此同时时，柱效效提高意意味着在在相同条条件下可可以选用用更短的的色谱柱柱，以缩缩短分析析时间。另另外，可可以采用用低粘度度的溶剂剂做流动动相或增增加色谱谱柱的使使用温度度，比如如用乙腈腈代替甲甲醇，以以降低色色谱柱的的压力。名称别名功能基团正相反相离子对应用Silica√非极性和中等极性以及非离子性有机化合物SASC1-OH√在所有的烷基键合相中对非极性于中等极化合物保留最弱；典型用于中等极性和多官能团化合物。BμtylC4-(CH3)3√√分离肚和蛋白质，保留时间比C8和C一八短。MOSC8,Octyl-C4H9√√中等极性到强极性化合物，小肽和蛋白质，极性药物、甾族环境样品。ODSC一八-C8H37√√烷基键合相中对中等极性化合物保留最强。广泛用于药物、甾族化合物、脂肪酸和环境样品。CPSCN,Cyano(Propylnitrile)-(CH2)3CN√√对极性化合物有独特的选择性，适合应用于正相分离。当用于反相系统时，其选择性与C8和C一八不同。在药学领域和复杂混合物的分离中应用广泛。APSNH2(Aminopropy)-(CH2)3NH2√√反相中分析糖类和其他极性化合物。弱阴离子交换，阴离子和有机酸则应用缓冲剂和有机改性剂做流动相。正相中与硅胶的选择性不同，分析芳香族效果很好。Phenyl-(CH3)C3H5√√芳香族化合物Diol-(CH2)2OCH2(CH2OH)2√√反相时，分离肽和蛋白质。正相时，与硅选择性相似，但极性较弱SCX强阳离子次换-(CH2)2C6H4SO3H-√有机碱SAX强阴离子交换-(CH2)3N+（(CH3)3√有机酸、核苷和核苷酸五、如何选选择保护护柱怎怎样选择择保护柱柱，但又又不影响响分离分分析?这这是色谱谱工作者者经常提提出的一一个问题题。通常常，在选选择保护护柱之前前首先要要考虑的的是样品品是否清清洁。对对于大部部分分析析工作者者来说，一一支lccm长的的保护柱柱便能提提供对柱柱子的保保护，工工作中发发现要经经常更换换1cmm的保护护柱，那那么应选选择2ccm或33cm长长的保护护柱。保保护柱越越长，自自然所装装填的色色谱填料料越多，则则其越能能避免污污染物进进入分析析色谱柱柱的机会会。当然然，随着着保护柱柱的长度度加长，样样品的保保留时间间会比使使用短保保护柱长长。一般来说，保保护柱的的内径与与分析色色谱柱的的内径相相同或相相当即可可。保保护柱的的填料装装填方式式也很重重要。目目前有薄薄膜装填填法的保保护柱，使使用过程程很简单单方便，而而且可以以在实验验室中进进行干装装。但是是，其最最大的缺缺点是不不经济，特特别是针针对中国国的具体体情况，一一次性使使用相对对费用较较高。另另外，薄薄膜装填填法的保保扩性所所装填的的色谱填填料有限限，只能能提供很很有限的的保护作作用；不不过也因因为所装装填的色色谱填料料较少，保保护柱的的长度也也较短，所所以对分分析样品品的保留留时间的的影响也也很小。另另一种保保护柱结结构其实实质是缩缩短了的的色谱分分析柱，设设计方式式上有直直连式、手手紧式或或整体式式。整体体式设计计是由色色谱柱的的生产厂厂商直接接安装在在色谱分分析柱上上的，必必须与色色谱分析析柱一同同订货，可可以非常常方便地地使用，但但不能够够被修改改。直连连式结构构设计可可在任何何时候由由色谱工工作者来来安装连连接，可可以与任任何品牌牌的色谱谱分析柱柱连接使使用，而而且还可可以根据据样品的的相关情情况选择择不同的的保护柱柱一样，只只是在连连接时不不需要借借助扳手手等工具具，直接接用手上上紧即可可。另外外从保护护柱结构构的角度度看，保保护柱的的结构又又分为是是否可以以更换保保护柱柱柱芯。现现在大多多数的保保护柱均均可以更更换保护护柱柱芯芯，可以以降低保保护柱的的使用成成本。大大多数人人是根据据色谱分分析柱的的填料选选择保护护柱的填填料，正正常情况况下可以以选择与与分析色色谱柱一一样的色色谱填料料。但是是，根据据实际的的分析工工作，也也可不必必与分析析色谱柱柱的填料料完全相相匹配。对对于选择择保护柱柱的原则则是：在在满足分分析分离离要求的的前提条条件下，尽尽可能地地选择较较短的保保护柱结结构，尽尽可能选选择对分分离样品品小一些些保留性性的填料料。六、故障与与解决的的方法选选样了一一根好的的柱子，再再加上有有效的维维护与预预防，可可以避免免不少意意外故障障的发生生。当然然谁也不不能保护护色谱柱柱“永远”不出故故障，任任何一根根色谱柱柱最终都都会因为为柱效下下降直到到报废。柱柱损坏的的标志是是：①塔板数数下降；；②峰形改改变；③③压力增增加；④④保留时时间变化化。有时时往往是是几种情情况伴随随着同时时发生。1、塔板数数下降在在色谱柱柱使用过过程中，塔塔板数会会不断下下降．一一般情况况下，进进20000个样样品后柱柱效N值值要降低低50％％，(但但也不能能一概而而论)，而而用C一一八，柱柱梯度分分析氨基基酸，进进1000个血清清样品之之后，柱柱效就下下降500%。这这两种情情况的差差别之所所以这么么大，关关键在于于处理样样品的方方法不同同。如如果柱效效很快下下降，应应考虑上上节所提提到的人人为不利利因素。NN值突然然下降((如一个个工作日日内)，应应考虑柱柱头塌陷陷或进了了不合格格的样品品。如果果使用了了不同系系统的色色谱柱造造成柱效效下降，是是某系统统中存在在柱外效效应。新新建立的的方法中中柱效下下降，可可能是样样品和其其它内在在因素引引起，此此时要采采取相应应措施，防防止继续续给柱造造成危害害。2、峰形变变坏出出现拖尾尾峰、分分叉峰或或非高斯斯峰的原原因很多多，但总总是与塔塔板数骤骤然下降降联系在在一起的的。峰形形变坏而而保留时时间不变变，多半半是柱受受到阻塞塞(不锈锈钢烧结结片)，或或者柱头头有了空空穴。3、压力增增加和和柱塔板板数不断断减少一一样，在在使用过过程中柱柱压慢慢慢增加，可可视为正正常。如如果压力力一下子子增加过过高，应应考虑两两种可能能，一是是样品沉沉积在柱柱内，二二是柱内内硬件阻阻塞(未未考虑系系统其它它部分的的阻塞))。对对于第一一种情况况，要用用能溶解解所用样样品的溶溶剂冲洗洗。冲洗洗时拆开开柱与检检测器之之间接头头，正向向冲洗或或将柱出出口接在在泵上反反向冲洗洗(如果果柱条件件许可))，使用用大约330～550mLL溶剂。不不要让冲冲洗液通通过检测测器流动动池，以以防污染染。在冲冲洗过程程中不断断检查，直直到压力力恢复正正常为止止。如冲冲洗无效效，应该该考虑是是第二种种情况，先先换烧结结不锈钢钢过滤片片，拆下下柱，拧拧开柱头头上的压压帽，持持垂直方方向小心心取出不不锈钢过过滤片，换换上新的的(不是是洗过的的旧滤片片)。换换滤片时时尽量不不要搅动动柱头填填料，如如有塌陷陷，可用用同种填填料中乙乙醇调成成糊状补补平柱头头，压紧紧，压平平，柱性性能可恢恢复如前前。如果果柱头填填料己脏脏，可挖挖去2～～3mmm，用新新填料补补平。4、保留时时间的改改变保保留时间间的变化化指两种种类型的的情况，第第一种是是同一根根柱样品品间的保保留变化化，第二二种类型型主要是是填料的的差异造造成的，许许多实验验都会碰碰到，现现讨论如如下。不不同牌号号的色谱谱柱分离离的色谱谱峰保留留时间可可在小范范围内移移动，但但峰的顺顺序和分分辨率不不变，可可改变流流速或溶溶剂强度度(反相相色谱加加水调节节)进行行校正。如如果谱图图中色谱谱顺序发发生了变变化，或或者两峰峰重叠在在一起，问问题就比比较严重重。保留留时间发发生大的的变化，主主要由柱柱填料硅硅酸相互互作用所所致，另另外有次次级保留留因素的的影响。硅硅胶为基基质的填填料表面面含有硅硅醇，有有的封尾尾填料可可部分去去掉硅醇醇、不封封尾填料料的硅胶胶表面硅硅醇基更更多。酸酸性或碱碱性分子子可与硅硅醇发生生不同程程度的相相互作用用。硅酸酸与样品品分子作作用的强强弱，因因不同批批号的硅硅胶和不不键合相相填料而而异。即即使同批批号的硅硅胶而不不同批号号的键合合相也有有差异。硅硅醇对阳阳离子或或碱性样样品影响响最大。参参照下列列要求做做可以减减少色谱谱柱之间间保留时时间的变变化。((1)仅仅用同一一厂商的的柱。实实际上不不具可操操作性，但但最起码码作某一一专门分分析方法法时要用用同一厂厂商的柱柱。((2)设设计分离离条件，使使保留值值变化最最小(建建立标准准的方法法)。((3)选选用液相相色谱系系统或色色谱柱对对次级保保留因素素(外界界)灵敏敏度最低低。((4)换换新柱时时调整分分析条件件保持旧旧柱的保保留值((改变条条件)。这这一步工工作是必必不可少少的，在在长期的的常规分分析中，不不会从头头至尾用用一根柱柱，中间间总要换换新柱，每每换一次次，都应应仔细地地调整各各组分的的保留。在在实际工工作中，应应考虑到到可能会会发生什什么问题题，怎样样预防这这些问题题的发生生。第第一，前前面提到到的作某某一专门门分析尽尽量用同同一批号号的柱。也也可与厂厂商接洽洽，提出出特殊的的要求。第第二，选选择硅醇醇影响最最小的分分离条件件，减少少柱间的的差异。如如在流动动相中添添加三乙乙胺抑制制硅醇的的作用。第第三，许许多色谱谱工作者者认为，在在流动相相中加入入离子对对试剂更更能抗硅硅醇的干干扰，使使保留具具有更好好的重复复性。不不管什么么情况下下引起保保留值的的明显变变化，都都应该改改善分离离条件。改改善特别别差的峰峰的分离离度，并并使保留留值稳定定下来。例例如用梯梯度洗脱脱分析体体液中的的氨基酸酸，这种种复杂的的样品有有20多多个组分分，保留留稍有变变化可能能对分离离就产生生灾难性性的结果果。一些些极端组组分，如如偏向酸酸性或碱碱性的组组分很易易发生保保留值的的改变，应应用不同同流动相相的组成成、pHH值和缓缓冲液的的浓度，可可以改善善关键色色谱峰间间的分离离。色谱谱峰分离离度变差差，可能能会系统统地改变变保留值值。塔塔板数降降低、压压力增高高、峰形形变差、保保留值变变化可能能同时发发生，可可能都是是由柱引引起的。下下表的内内容可帮帮助找到到一些故故障的原原因，有有些内容容将在后后面的章章节中详详细讨论论。表11-11由由柱引起起的故障障故障现象解决办法过滤片阻塞柱头塌陷键合相流失样品阻塞强吸附的样品压力增高，N下降，峰形差峰分叉，N下降保留改变，峰形差，N下降高压N下降，保留减小倒柱冲洗或换过滤片修补柱头，可恢复80％以上换柱用能溶解样品的溶剂冲洗柱强溶剂反冲七、延长柱柱寿命的的方法一一根柱到到了不可可使用的的时候应应更换。“不可挽救”这个概念在许多色谱工作者的认识上不完全相同，有人认为只有当柱的压力增高到系统不可承受的地步才考虑报废，只要压力在可接受的范围内总要设法修补，以延长柱的寿命。．另外也可以从分析高要求的样品改作分析低要求的样品，从分离多组分的样品改作分离单组分的样品，从分离介质复杂的样品改为分离介质相对简单的样品。实验室最常用的延长柱寿命的方法是修补柱头、换不锈钢烧结片，冲洗、倒冲柱。修修补柱头头和换不不锈钢结结片常联联系在一一起，前前面已简简单作了了叙述。去去掉过滤滤片后发发现柱头头塌陷或或填料被被污染，可可用无水水乙醇调调成糊状状的同种种填料((挖去脏脏填料))填补柱柱头，用用与柱内内径相同同的、顶顶端平而而光滑的的不锈钢钢或聚四四氟乙烯烯棒压紧紧，再填填平，再再压紧，反反复3～～5次，最最后用无无水乙醇醇将柱头头四周润润湿几次次，擦干干净柱外外壁的填填料、加加上新过过滤片，拧拧紧接头头，接上上泵冲洗洗，而后后再接检检测器。如如果塌陷陷很深，或或者挖去去的脏填填料很多多，填平平柱头后后接上泵泵冲洗一一五miin，再再拆下柱柱填平，再再接上泵泵冲洗，反反复数次次可恢复复大部分分柱效。有有时还应应该用比比较高的的流速才才能有效效。修修补过的的柱一般般不能恢恢复到原原先的柱柱效，刚刚开始修修补数次次效果不不错，随随着修补补次数的的增多，维维持一个个短时间间又要修修补，到到了后期期，键合合相随硅硅胶的溶溶蚀而流流失，加加上化学学物质的的腐蚀，此此时再也也无法修修补了。对对价格高高的柱一一定坚持持自己动动手修补补。如排排阻色谱谱柱不随随时间而而改变保保留，仅仅需比较较低的分分离条件件，稍为为修补就就可解决决问题。倒倒冲柱也也是经常常采用的的维护措措施，不不提倡新新柱倒冲冲柱。色色谱柱用用到中后后期，而而且修补补过多次次后才考考虑逆向向反冲。可可在倒冲冲柱前填填平原柱柱头的塌塌陷现冲冲洗，也也可倒向向冲洗后后再填平平柱头((原柱出出口)，后后者效果果好一些些。柱逆逆向使用用后柱效效损失较较大(约约40％％～600％)，常常常可以以倒过来来再倒过过去，只只要不破破坏柱床床，效果果还不错错。倒冲冲柱前要要检查柱柱两端的的烧结过过滤片情情况，防防止烧结结过滤片片(原柱柱头承受受过度压压力，填填料被泵泵打出))。在在采取以以上措施施时，冲冲洗过程程应伴随随始终。有有少数实实验室自自己装柱柱，或请请厂商装装柱。柱柱硬件都都是用过过的旧柱柱，这可可节约550％的的经费，但但有时也也碰到一一些麻烦烦。柱内内壁未经经再抛光光处理，柱柱壁效应应比较大大，分辨辨率降低低，或者者拖尾峰峰。重装装柱后卡卡套易松松动，整整个柱头头渗漏。可可借助于于聚四氟氟乙烯软软膜密封封，但已已不能承承受较高高的压力力。对对有些柱柱重新处处理是值值得的，但但有些则则无价值值。除考考虑价格格外，还还要考虑虑实际工工作要求求。任何何柱都可可以修补补数次，样样品处理理好、流流动相温温和、压压力中下下可以减减少修补补柱的次次数。柱柱压升高高超过系系统所承承受的限限度就要要报废柱柱。实验验室内要要备有不不同类型型的散装装填料((C一八八、硅胶胶)，用用同类型型、同粒粒度的填填料修补补柱头效效果好。如如果手头头没有所所要求的的填料，可可以用其其它填料料代替，这这比用柱柱头塌陷陷的柱要要好得多多。八、如何解解决色谱谱柱使用用过程出出现的问问题1.保留值值与分离离度重现现性不好好原因分分析问题原因表现不同色谱柱间差异使用期间柱变化填料、键合相不同柱床破坏键合相丢失硅胶基质溶解强保留组分堆积堵塞保留因子(k)，分离因子(α)柱效(N)保留因子(k)，分离因子(α)柱效(N)保留因子(k)，柱效(N)柱外效应系统差异、进样量大、进样阀与色谱柱之间、色谱柱与检测器之间的管路太长、检测器流通池体积大、接头死体积大等。柱效（N)分离效果变差流动相组分改变流速改变温度改变保留因子(k)，柱效变化很小保留因子(k)，分离因子（α）保留因子(k)，柱效变化很小柱平衡慢重新平衡时间不够保留因子(k)，柱效变化很小柱超载样品量太大保留因子(k)，柱效(N)液相色谱培训讲义(十一)x

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发布日期：2007-5-22八、如何解决色谱柱使用过程出现的问题1.保留值与分离度重现性不好原因分析问题原因表现不同色谱柱间差异使用期间柱变化填料、键合相不同柱床破坏键合相丢失硅胶基质溶解强保留组分堆积堵塞保留因子(k)，分离因子(α)柱效(N)保留因子(k)，分离因子(α)柱效(N)保留因子(k)，柱效(N)柱外效应系统差异、进样量大、进样阀与色谱柱之间、色谱柱与检测器之间的管路太长、检测器流通池体积大、接头死体积大等。柱效（N)分离效果变差流动相组分改变流速改变温度改变保留因子(k)，柱效变化很小保留因子(k)，分离因子（α）保留因子(k)，柱效变化很小柱平衡慢重新平衡时间不够保留因子(k)，柱效变化很小柱超载样品量太大保留因子(k)，柱效(N)2.造成色谱峰(不对称)拖尾的原因(1)色谱柱本身填装问题，筛板堵塞或填料塌陷(2)柱头有污染(3)样品超载(4)样品溶剂不合适(5)柱外效应(6)化学或二次保留(硅羟基)效应(7)缓冲容量不足或不合适(8)重金属污染3.如何解决峰形拖尾的问题A、与化学有关的拖尾问题(1)流动相中，加入30mM的三乙胺(用于碱性化合物)或醋酸胺(用于酸性化合物)，未知化合物加醋酸三乙胺；(2)如仍然拖尾，将三乙胺换为二甲基辛胺（或醋酸二甲辛胺）；(3)降低进样量到<1μg。B、与色谱柱有关的拖尾问题(l)如柱头处有强保留的样品组分积聚，反相柱可用20倍柱体积的96％的二氯甲烷与4％甲醇，加l％氢氧化铵混合液冲洗；正向柱可用甲醇冲洗；(2)使用保护柱；C、与HPLC系统有关的峰拖尾和峰加宽(1)进样体积过大，(通常≤25μL)：(2)进样阀与色谱柱及检测器之间的管路体积过大(最佳连接管应<20cm，内径为0.007″)；(3)检测器流通池的体积过大。4.如何贮存色谱柱(1)防止缓冲溶液和水溶液流动相产生微生物，做到流动相用多少配多少，或在水流动相中加20ppm叠氮钠以抑制细菌生长(一定当心其毒性和潜在的爆炸性)；或在流动相中加20％的有机改性剂，也可抑制微生物生长，有机改性剂还有助于流动相脱气。(2)尽可能将色谱柱贮存于100％有机溶剂(乙腈最好)中，避免在缓冲液中保存。(3)使用缓冲液后的色谱柱，应用一五～20倍柱体积的不含缓冲剂的同种水-有机溶剂流动相冲洗色谱柱换成100％有机溶剂贮存。(4)避免用纯水冲洗键合致密的C一八柱。(5)将色谱柱两端用堵头拧好，以免柱床填料干裂。九、谱图问题液相色谱系统的许多问题都能在谱图上反映出来，其中有一些问题可以通过改变设备参数得到解决，而其他的问题必须通过修改操作程序来解决，对于色谱柱和流动相的正确选择是得到好的色谱图的关键。A、峰拖尾原因解决方法1、筛板阻塞1、a、反冲色谱柱b、更换进口筛板c、更换色谱柱2、色谱柱塌陷2、填充色谱柱3、干扰峰3、a、使用更长的色谱柱b、改变流动相或更换色谱柱4、流动相pH选择错误4、调整pH值。对于碱性化合物，低pH值更有利于得到对称峰5、样品与填料表面的活性点发生反应5、a、加入离子对试剂或碱性挥发性修饰b、更改色谱柱B、峰前延原因解决方法1、柱温低1、升高柱温2、样品溶剂选择不恰当2、使用流动相作为样品溶剂3、样品过载3、降低样品含量4、色谱柱损坏4、见A1、A2C、峰分叉原因解决方法1、保护柱或分析柱污染1、取下保护柱再分析。也可更换保护柱。拆下来清洗。如果问题仍然存在，可能是柱子被强保留物质污染，可运用适当的再生措施。若还不行，可能是入口处堵，可以更换筛板或色谱柱。2、样品溶剂不溶于流动相2、改变样品溶剂，如果可能，采取流动相作为样品溶剂D、含量高的成分峰原因解决方法1、样品溶剂选择不恰当1、减少样品载量E、早出的峰变形原因解决方法1、样品溶剂选择不恰当1、a、减少进样体积b、运用低极性样品溶剂F、早出的峰拖尾程度大于晚出的峰原因解决方法1、柱外效应1、a、调整系统连接（使用更短、内径更小的管路）b、使用小体积的流通池G、K′增加时，脱尾更严重原因解决方法1、二级保留效应，反相模式2、a、加入三乙胺b、加入乙酸c、加入盐或缓冲剂d、更换一支柱子2、二级保留效应，正相模2、a、加入三乙胺b、加入乙酸c、加入水d、试用另一种方法3、二级保留效应，离子对3、加入三乙胺H、酸性或碱性化合物的峰拖尾原因解决方法1、缓冲不合适1、a、使用浓度50-100mmol/L的缓冲液b、使用Pka等于流动相PH值的缓冲液I、额外的峰原因解决方法1、样品中有其他组分1、正常2、前一次进样的洗脱峰2、a、增加运行时间或梯度b、使用pH等于流动相pH的缓冲液3、空位或鬼峰3、a、检查流动相否纯净b、使用流动相作为样品溶剂c、减少进样体积J、保留时间波动原因解决方法1、温控不当1、重新设定柱温2、流动相组分变化2、防止变化（蒸发、反应等）3、色谱柱没有平衡3在每一次运行之前给予足够的时间平衡色谱柱K、保留时间不断变化原因解决方法1、流速变化1、重新设定流速2、泵中有气泡2、从泵中除去气泡3、流动相选择不恰当3、a、更换合适的流动相b、选择合适的混合流动相L、基本漂移原因解决方法1、柱温波动（即使是很小的温度变化都会引起基线的波动。通常影响示差检测器、电导检测器较高灵敏度的紫外检测器或其它光电类检测器。）1、控制好柱子和流动相的温度，在检测器之前使用热交换器。2、流动相不均匀。（基线向上漂移，流动相条件变化引起的基线漂移大于温度导致的漂移）。2、使用HPLC级的溶剂，高纯度的盐和添加剂。流动相在使用前进行脱气，使用过程中用氦气3、检测器内流通池被污染或有气体3、用甲醇或其他强极性溶剂冲洗流通池，如有需要，可以用1mol的硝酸（不要用盐酸）。4、检测器出口阻塞。（高压造成流通池窗口破裂，产生噪音基线）4、取出阻塞物或更换管子。参考检测器手册换流通池窗。5、流动相配比不当或流速变化5、更改配比或流速。为避免这个问题可定期检查流动相组成及流速。6、柱平衡慢，物别是流动相发生变化时6、用中等强度的溶剂进行冲洗，更改流动相时，在分析前用10-20倍体积的新流动相对柱子进行冲洗。7、流动相污染、变质或由低质量溶剂配成7、检查流动相的组成。使用高质的化学试剂及HPLC级的溶剂。8、样品中有强保留的物质（高K′值）以馒头峰样被洗脱出，从而表现出一个逐步升高的基线。8、使用保护柱，如有必要，在进样之间或在分析过程中，定期用强溶剂冲洗柱子。9、使用循环溶剂，但检测器未调整。9、重新设定基线。如循环溶剂已超阶级出检测器动力学范围，使用新的流行动相。10、检测器没有设定在最大吸收波长。10、将波长调整至最大吸收波长处。M、基线噪音（规则的）原因解决方法1、在流动相、检测器或泵有空气1、流动相脱气，冲洗系统以除去检测器或泵中的空气。2、漏液2、见第三节。检查管路接头是否松动，泵是否漏液，是否有盐析出和不正常的噪音。如有必要，更换泵密封。3、流动相混合不完全3、用手摇动使混合均匀合均匀或使用低粘度的溶剂4、温度影响（柱温过高，检测器未加热）4、减少差异或加上热交换器5、在同一地线上有其他电子设备5、断开LC、检测器和记录仪，检查干扰是否来自于外部，加以更正。6、泵脉冲6、在系统中加入脉冲阻尼器液相色谱培培训讲义义(十二二)x

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发布布日期：：20007-55-222N、基线噪音（不规则的）原因解决方法1、漏液1、见第三节。检查接头是否松动，泵是否漏液，是否有盐析出和不正常的噪音。如有必要，更换密封。检查检测器流通池是否漏液。2、流动相污染、变质或由低质溶剂配成2、检查流动相的组成。3、流动相各溶剂不相溶3、选择互溶的流动相4、检测器内有气泡4、断开检测器的记录仪的电源，检查并更正。5、系统内有气泡5、用强极性溶液冲冼系统6、检测器内有气泡6、冲洗检测器，在检测器后面安装背景压力调节器7、流通池污染（即使是极少的污染物也会产生噪音。）7、用1N的硝酸（不能用磷酸）清洗流动池8、检测器灯能量不足8、更换灯9、色谱柱填料流失或阻塞9、更换色谱柱10、流动相混合不均匀或混合器工作不正常10、维修或更换混合器，在流动相不走梯度时，建议不使用泵的混合装置。O、峰变宽原因解决方法1、流动相组成变化1、重新制备新的流动相2、流动相流速太低2、调节流速3、漏液（特别是在柱子和检测器之间）3见第三节。检查接头是否松动、泵是否漏液、是否有盐析出以及正常的噪音。如果必要更换密封。4、检测器设定错误4、更改检测器参数设置5、a、柱子过载b、检测器响应时间过长或池体积过大c、柱子与检测器之间的管路太长或管路内径大d、模数转换频率过低5、a、小体积进样，稀释样品b、减少响应时间或使用更小的流通池c、使用内径为0.007-0.01”的管路d、将模数转换频率增大6、缓冲液离子强度太低6、增加离子强度7、保护柱污染或失效7、更换保护柱8、色谱柱污染或失效，塔板数降低8、更换同样类型的色谱柱。9、柱头污染或塌陷9、更换柱子10、呈现两个或多个未被完全分离的峰10、选择其它类型的色谱柱以改善分离效果11、柱温过低或柱温不均匀11、选择设计合理的柱温设备,提高柱温。12、检测器响应时间太大12、使用较小的响应时间P、分离度降低原因解决方法1、流动相污染或变质（引起保留时间变化）1、重新配制流动相2、保护柱或分析柱2、取下保护柱再分析，也可更换保护柱，若问题仍然存在，可能是柱子被强留物质污染，再生色谱柱，若问题仍然存在,更换色谱柱。Q、所有的峰面积都变小/变大原因解决方法1、检测器衰减设定过高/低1、减少/增加衰减的设定2、检测器响应时间太大2、设定较小的响应时间3、进样量太少/过多3、增大/减小进样量4、输出连接不当4、使用正确的连接十、色谱柱柱工作程程序1.1新购购的色谱谱柱（分分析柱）须须建立档档案才能能启用。1.2柱子子的选用用，原则则上一根根色谱柱柱只能用用于同类类物质的的分析。1.3使用用色谱柱柱时，应应在色谱谱柱前加加同种填填料和规规格的保保护柱（预预柱）1.4色谱谱柱与预预柱一经经使用，就就应该标标明方向向，不可可倒过来来使用。1.5柱子子（预柱柱或分析析柱）的的连接1.5.11预柱、分分析柱与与管路的的连接，总总的原则则是要尽尽量避免免死体积积的增大大。因而而，在拧拧紧螺丝丝前一定定要把不不连接管管尽量往往柱子里里塞。在在使用通通用接头头时，即即使在拧拧紧的过过程中也也要注意意边塞边边拧，以以免在拧拧动的过过程中，管管子松开开。预柱柱与分析析柱的连连接管应应尽量短短。1.5.22在使用用不锈钢钢固定接接头时，要要注意不不能拧得得太紧，以以免螺丝丝尖端的的一截管管子和金金属刃环环变形。不不同公司司的柱子子的柱头头不一样样，插进进去的管管子的深深度、刃刃环的角角度也不不一样，因因而不锈锈钢接头头不能通通用。1.6色谱谱柱的使使用1.6.11流动相相流速一一般应在在1.55mL//minn以内，柱柱内径越越大，可可用的流流速越大大；填料料颗粒越越细，可可用的流流速越小小。1.6.22流动相相的pHH值：以以硅胶为为载体的的色谱柱柱，应在在2～77.5之之间，最最好在22.5～～7.00之间，其其它色谱谱柱参照照说明书书的规定定。1.6.33使用含含盐或缓缓冲液的的流动相相时，使使用前一一般先用用10..0mLL以上的的水（或或用无盐盐流动相相）过渡渡。1.7色谱谱柱的清清洗1.7.11对于无无盐流动动相,样样品分析析完成后后,一般般应用流流动相继继续冲洗洗60mmL以上上，再根根据样品品成分的的溶解性性质，选选用合适适的纯有有机溶剂剂或水冲冲洗，必必要时测测定柱效效。1.7.22如果流流动相含含有盐或或者缓冲冲液，先先用相应应的无盐盐流动相相冲洗660mLL以上，再再用水冲冲洗1000mLL以上，再再根据样样品成分分的溶解解性质，选选用合适适的纯有有机溶剂剂冲洗，必必要时测测定柱效效。1.7.33色谱柱柱冲洗干干净的确确认：如如果没有有时间测测定柱效效，应保保证柱压压恢复正正常；而而且，在在2544nm处处检测基基线，220分钟钟内保持持平稳。1.7.44预柱的的冲洗：：如果预预柱太脏脏，应该该单独冲冲洗，以以免污染染分析柱柱，国产产的预柱柱必要时时可以用用长时间间的倒冲冲的方法法把脏物物冲洗：：Pheenommeneex公司司的预柱柱不能倒倒冲，如如果预柱柱洗不干干净，交交由仪器器管理人人员处理理，新预预柱的柱柱压一般般在1000pssi以下下，如果果柱压变变得很大大，应考考虑预柱柱已经变变脏、被被堵塞了了。1.7.55柱效及及分离度度的测定定1.7.55.1使使用完毕毕，必要要时用稠稠环芳烃烃测定柱柱效（不不带预柱柱），如如果发现现柱效下下降，或或分离度度变差，必必须查找找原因，采采用合适适的溶剂剂进一步步冲洗柱柱子，直直到基本本恢复正正常。1.7.55.2测测定方法法：样品：1000mLL（含苯苯0.335mll+联苯苯3mgg+萘220mgg+菲330mgg）测定波长：：2544nm；；流动相：885%甲甲醇水；；进样量：55μL。1.8色谱谱柱的封封存：反反相色谱谱柱应保保存在550%以以上的甲甲醇/乙乙腈中，正正相色谱谱柱应保保存在正正已烷中中，存放放达半年年时要重重新冲洗洗，以免免溶剂挥挥发，柱柱床变形形。1.9记录录：分析析完成后后应作记记录。1.10正正反相的的转换：：由反相相到正相相，依次次用水、甲甲醇-异异丙醇--正已烷烷冲洗；；由正相相到反相相的转换换，依次次用正已已烷-异异丙醇--甲醇--水冲洗洗。1.11柱柱压及色色谱柱压压（不带带预柱）上上升，应应查找原原因，采采用合适适的溶剂剂（如甲甲醇、乙乙腈、四四氢呋喃喃、氯仿仿、异丙丙醇、乙乙醚等）进进一步冲冲洗柱子子，直到到柱效、柱柱压恢复复正常。如如果还不不行，可可以把柱柱子倒过过来冲洗洗，不过过须冲洗洗比较长长的时间间，因为为柱床重重新平衡衡需要一一定的时时间，倒倒过来冲冲洗，应应倒着使使用，不不用再倒倒回去使使用，以以免又需需再次平平衡柱床床（当然然，倒着着用一段段时间后后，如果果柱压又又上升了了，还可可以倒回回去冲洗洗、使用用）。每每倒转一一次，应应重新测测定柱效效。1.12色色谱柱的的报废：：色谱柱柱的报废废没有具具体的时时间，有有些色谱谱柱已不不能用于于测定某某一物质质了，但但用于测测另外的的物质却却可能还还很好。一一般经过过多次维维修，柱柱压仍太太高时，可可以报废废。用稠稠环芳烃烃测得柱柱效测得得柱效和和分离度度达不到到，经过过冲洗、修修理仍无无改善时时，也可可以报废废。注意事项：：反相柱柱不能用用纯水冲冲洗，流流动相中中有机相相的比例例必须在在5%以以上。液相色谱培培训讲义义(十三三)x

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发布布日期：：20007-55-222第十二章液相色色谱仪器器故障及及排除方方法第一节故障分分类、识识别与排排除表本书中故障障排除表表的编排排按照故故障现象象的分类类（包括括整机、部部件、色色谱图、引引起原因因等）加加以整理理，在许许多情况况下可能能有重复复描述的的，这是是因为一一种故障障症状的的出现，往往往是由由许多原原因造成成，可以以从色谱谱图中得得到信息息，也可可以从各各部件的的运转情情况推测测，直至至操作者者应运用用自己的的全部知知识与经经验进行行综合分分析、推推断、并并通过各各种可能能的尝试试，作出出正确的的判断。为了更加直直观地快快速判断断问题所所在。本本章中，尽尽量用各各种图表表形式。表12-11系统统流路问问题造成成的基线线故障排排除方法法症状可能原因解决方法不规则的噪噪声(产生于系系统流路路)检测器流通通池内有有较大气气泡排气泡，清清洗检测测池或在在检测器器废液排排放口加加适当的的回压调调节器；；在检测测器废液液排放回回压不规则的噪噪声(产生于系系统流路路)流路中有少少量气泡泡排气泡（为为预防气气泡，流流动相要要脱气或或通氦气气）系统不稳定定或没达达到化学学平衡使系统所有有部件（如如柱和检检测器）有有适当时时间获得得稳定和和化学平平衡；如果使用自自动梯度度洗脱，要要有足够够的平衡衡时间获获得好的的再现性性；如使用离子子对试剂剂，在首首次使用用时需要要足够的的时间和和溶剂体体积，色色谱柱才才能达到到足够的的平衡。流动相被污污染不使用这些些流动相相并且：：（1）清洗洗贮液器器，过滤滤器（66moll/LHNOO3）水（重复三三次）。甲甲醇/换换溶剂入入口过滤滤器（2）建议议用HPPLC级级试剂（3）冲洗洗并重新新平衡系系统检测器流通通池漏移开检测器器盖子检检查泄漏漏，如果果看不到到，按下下面步聚聚进行：：（1）用可可溶性好好的非缓缓冲液溶溶剂清洗洗检测器器，然后后用甲醇醇清洗（2）通氦氦气或氦氦气，慢慢慢将检检测池吹吹干检测器流通通池漏监测基线噪噪声，如如果噪声声消失，表表明检测测池内部漏，需修修理/更更检测池池规则的噪声声(产生于系系统流路路)检测器流通通池漏监测基线噪噪声，如如果噪声声消失，表表明检测测池内部部漏，需需修理//更换检检测池色谱柱被污污染为证明可能能的原因因更换系系统的色色谱柱或或使用一一根同类类的被证证明性能能好的色色谱柱换流动相监监测基线线如果问题仍仍然存在在可能由由于：（1）

溶溶剂的性性质（如如不互溶溶）（2）

流流动相被被玷污（3）

保保护柱或或管路过过滤器被被玷污表12-22检检测器电电路引起起的基线线噪声故故障排除除方法症状可能原因解决方法无规则噪声声(产生于检检测器))检测器没有有稳定检测器灯应应有适当当时间稳稳定（直直到基线线稳定）灯故障(产生于检检测器))检测器灯检测器平衡衡时间的的变化取取决于使使用的检检测器种种类和参参数（如如波长、灵灵敏度、电电压/电电流等）按检测器说说明书检检查器可可以调证证灯能量量以补偿偿量损失失无规则噪声声(产生于检检测器))检测池被污污染参见检测故故障排除除检测器电路路问题检测器故障障，与供供应商联联系检测器与数数据处理理系统信信号线连连接不好好将连接线接接好检测器接地地不好使用专用的的、有屏屏蔽的信信号线周围使用设设备的影影响使用单独电电源，远远离有强强电磁波波、强磁磁场的设设备数据处理装装置灵敏敏度设置置太灵敏敏调到灵敏度度合适的的位置有规则期（分分或秒）噪噪声（产产生于检检测器）周周围设备备的影响响周围使用设设备的影影响参见上述“不规则则的噪声声”解决办办法检测器内部部控温器器不合适适（开//关过于于频繁）正确设置检检测器内内部控温温参数长期（分或或小时）有规则噪声声(产生于检检测器))室温波动稳定室温至至系统完完全平衡衡，如果果问题继继续存在在，则：：（1）将检检测器置置于无空空气对流流的恒温温环境中中（2）检测测器避免免阳光直直射周围使用设设备的影影响参见上述“不规则则的噪声声”解决办办法基线漂移(产生于检检测器))检测器不稳稳定参见上述“不规则则的噪声声”解决办办法室温变化参见上述“长期有有规则噪噪声”解决办办法检测池被污污染参见检测器器故障排排除出现脉冲式式噪声(产生于检检测器))检测器灯参见上述“不规则则的噪声声”解决办办法周围使用设设备的影影响参见上述“不规则则的噪声声”解决办办法检测器电路路问题检测器故障障，与供供应商联联系表12-33保保留时间间改变//错误的的故障排排除方法法症状可能原因解决方法每次进样时时的保留留时间不不重复由于气泡，各各部件磨磨损等原原则引起起泵故障障或泵脉脉冲输液液不稳定定如果压力不不稳继续续存在，见见泵故障障排除法法系统不稳或或未达到到化学平平衡应有足够时时间使所所有的部部件（如如检测器器、柱等等）达到到平衡，注注意使用用的操作作条件（如如流动相相、检测测器数设设置、检检测器类类型等）如果进行的的是梯度度洗脱，在在两次进进样期间间应有足足够的时时间以保保证再现现性如使用离子子对试剂剂应保证证第一次次使用时时要有足足够的时时间和足足够的溶溶剂体积积使色谱谱柱达到到平衡每次进样时时的保留留时间不不重复进样体积太太大或样样品浓度度太高（过过载）平平衡被破破坏如果压力不不稳继续续存在，见见泵故障障排除法法室温波动大大稳定环境温温度，如如果问题题继续存存在，测测：（1）用柱柱恒温箱箱，（室室温5℃℃以上）（2）将系系统置于于恒温、空空气对流流小的环环境溶剂配比不不合适解决步骤如如下：（1）流动动相预混混合、过过滤和脱脱气（2）用溶溶剂平衡衡色谱柱柱（3）至少少进标准准样三次次，比较较保留时时间的重重现性，如如果保留留时间重重现性好好，表明明是溶剂剂配比的的问题保留时间变变化新的恒恒定值（重重复但不不正确）对样品来说说流动相相不正确确或组成成不对配制新的流流动相泵流速改变变设置合适的的流速由于泵不稳稳导致输输液流速速不正确确用称重法测测量流速速的准确确性，如如果测得得值与设设置值不不同，证证明是泵泵的问题题，参见见泵故障障的排除除室温变化参见“保留留时间不不重复”的解决决方法柱恒温箱温温度设备备有误设置正确的的温度使用的色谱谱柱类型型或尺寸寸不正确确用一新的相相同的色色谱柱作作比较保留时间变变化至一一新的恒恒定值（重重复但不不正确）流动相中有有稳定剂剂或稳定定剂改变变使用无防腐腐剂的溶溶剂柱被污染参见“保留留时间连连续向一一个方向向增大或或减小”的解决决方法系统的梯度度延迟时时间设置置不正确确流路系统有有无变化化（如梯梯度混合合气的加加入，如如果有变变化重新新计算新新的延迟迟时间表12-44不正正常峰形形的故障障排除方方法症状可能原因解决方法无峰检测器选择择错误（如如波长、灵灵敏度、自自动回零零等）设置正确的的检测器器参数检测器输出出没回零零检测器基线线回零由于电源、电电路检测测池造成成的检测测器问题题参见检测器器故障排排除检测器与数数据处理理装置线线路连接接错误检测器输出出信号，正正确连接接使用错误的的流动相相配制新的流流动相如果问题发发生时系系统压力力很高，则则表明样样品中有有沉淀样品降解验证样品的的完整性性，检查查样品处处理过程程，更换换新的样样品色谱峰比预预计的小小（灵敏敏度降低低）进样体积错错误；进样器样品品定量环环大小不不合适改变到合适适的进样样体积；；检查进样器器样品定定量环，如如需要更更换合适适尺寸的的样品定定量环检测器设置置不当（如如波长、灵灵敏度等等）设备正确的的检测器器参数检测器输出出没回零零检测器基线线调零检测器信号号与数据据处理系系统不匹匹配参见上述“无峰”故障排排除法检测器灯故故障用检测器诊诊断步聚聚检查灯灯能量，如如果灯能能量低于于指标要要求（与与新灯比比较）更更换灯有有些检测测器可以以调整灯灯能量以以补偿能能量损失失进样问题（瓶瓶号错、进进样体积积不适合合、进样样错误、针针头阻塞塞）参见进样器器故障排排除法样品黏度太太大稀释样品，慢慢速抽取取样品峰变宽（保保留时间间短的峰峰）进样体积太太大或样样品浓度度太高（样样品过载载）平衡衡破坏；；减小进样体体积或用用流动相相稀释样样品：如如果使用用弱溶剂剂，进样样体积可可达柱死死体积的的10%%；管路内径错错误，管管路切割割时操作作不当，接接头套圈圈不合适适见管路的故故障排除除内容过滤器、保保护入口口、柱入入口或连连接管路路有部分分阻塞检查这些部部件的情情况，更更换堵塞塞管路，清清洗相关关部件进样器问题题（如阀阀漏、针针头阻塞塞或损坏坏，进样样孔被堵堵住）参见进样器器故障排排除法使用了错误误的进样样器样品品定量环环检查进样品品定量环环，如需需要，更更换合适适尺寸的的样品定定量环检测器时间间常数设设置错误误设置正确的的参数峰变宽（所所有的峰峰）柱或保护柱柱被污染染清洗柱或保保护柱，如如果问题题继续存存在，更更换柱性能下降降或失效效检查柱数（NN），如如果柱效效降低（与与新柱比比），更更换保护柱性能能下降换保护芯对于流动相相来说样样品溶剂剂太强解决方法如如下：（1）用流流动相溶溶解样品品（2）用弱弱溶剂稀稀释（3）减少少进样量量使用错误的的色谱柱柱（类型型或尺寸寸）用一新的相相同规格格的色谱谱柱作比比较室温变化使用柱恒箱箱温度变化可可导致保保留时间间变化（再再现性好好，但值值不正确确）系统没稳定定或未达达到化学学平衡应有足够时时间使所所有的部部件（如如检测器器、柱等等）达到到平衡，注注意使用用的操作作条件（如如流动相相、检测测器参数数设置、检检测器类类型等）；；如果进行的的是梯度度洗脱，在在两次进进样期间间应有足足够的时时间以保保证再现现性；如使用离子子对试剂剂，应保保证第一一次使用用时要有有的足够够的时间间和足够够的溶剂剂体积使使色谱柱柱达到平平衡。记录仪走纸纸速度不不合格调整到合适适的纸速速出现双峰//肩峰保护柱或柱柱入口处处部分阻阻塞见上述“峰峰变宽”的故障障排除方方法柱或保护柱柱被污染染清洗柱或保保护柱，如如果问题题继续存存在，更更换柱性能下降降见上述“峰峰变宽”的故障障排除方方法保护柱失效效换保护芯进样体积太太大或样样品浓度度太高（样样品过载载），平平衡破坏坏见上述“峰峰变宽”的故障障排除方方法前沿峰进样体积太太大或样样品浓度度太高（样样品过载载），平平衡破坏坏见上述“峰峰变宽”的故障障排除方方法对于流动相相来说样样品溶剂剂太强见上述“峰峰变宽”的故障障排除方方法柱或保护柱柱被污染染清洗柱保护护柱，如如果问题题继续存存在，更更换柱性能下降降见上述“峰峰变宽”的故障障排除方方法保护柱失效效换柱芯液相色谱培培训讲义义(十四四)x

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发布布日期：：20007-55-222拖尾峰柱或保护柱被污染清洗柱或保护柱，如果问题继续存在，更方柱性能下降见上述“峰变宽”的故障排除方法保护柱失效换柱芯进样器问题（如阀漏等）见进样器故障的排除方法检测器参数错误（如波长、灵敏度、自动回零）设置正确的参数记录仪输入电压错误调整记录仪输入电压进样体积太大或样品浓度过高风上述“峰变宽”的故障排除方法出现负峰（所有峰）连接数据处理系统信号线接反正确连接记录仪或检测信号极性相反改变极性设置光学系统没平衡（RI检测器）参见仪器使用手册出现一个或几个负峰离子对分离体系对峰的影响在流动相中溶解样品样品中有比流动相差的折指数低的组分（只限于RI检测器）检测负峰是否由于样品溶剂杂质所致；如果峰影响分析结果，改进方法；如果负峰是由于溶剂杂质所致，使用新处理的溶剂使用的流动相吸收高使用流动相稀释样品，如果问题继续存在，调整流动相使负峰不干扰分析结果；使用紫外截止波长外的流动相或改变溶剂自动进样器注射进空气参见上述进样器故障的排除方法表12-55定性、定定量结果果不正确确的故障障排除方方法症状可能原因解决方法（一）定性结果峰不能分辨数据处理装置输入了不正确的参数输入下列参数：（1）样品表：（2）校正表：（3）参考峰；（4）峰窗口；（5）峰临界值；（6）峰积分；（7）保留时间经适当改变后重新进标准样，提高准确度改变保留时间参见上述“保留时间不正确/改变”的故障除方法无峰数据处理装置输入了不正确的参数参见上述“色谱不能分辨”的故障排除方法改变保留时间参见上述“保留时间不正确/改变”的故障排除方法色谱图中出现多个鬼峰流动相被污染放弃使用被污染的流动相并：（1）清洗溶剂贮液瓶，清洗/溶剂入口过滤器，用6mol/L硝酸，水（重复三次），甲醇超声清洗过滤器（2）使用HPLC级试剂（3）重新平衡系统样品预处理时产生降解或混入杂质用标准样比较验证样品的完整性，检查样品处理过程，换新样品先前进样的流出物增加分析时间，如果问题继续存在，两次进样间用强溶剂冲洗色谱柱样品定量管清洗不当两次进样间冲洗样品定量管注射器脏使用干净的注射器，冲洗进样口柱被污染清洗柱和更换柱进样装置被污染冲洗进样器和样品定量环，如需要，换密封垫和过滤器流动相中含有稳定剂/稳定剂变化使用无防腐剂溶剂色谱图中出现个别鬼峰样品降解参见上述“色谱图中出现多个鬼峰”的故障排除方法分辨下降进行色谱仪性能试验使用了错误的流动相确认流动相对样品的合适情况，换新批号流动相如果问题发生在高压系统，将会有样品沉淀（二）定量结果准确度降低峰高/峰面积分值不正确设下列参数：（1）样品量（2）换算比例（3）内标物量（4）保留时间经适当变化后，重新进标样提高试验精度样品预处理时样品降解或样品不纯参见上述“色谱图中出现多个鬼峰”的故障排除方法样品蒸发样品密封保存在适当温度下样品前处理不当检查样品制备过程（浓度、溶剂过滤等）内标物配制不当验证内标物配制/混合过程（称量和适当稀释）；配制新内标物进样问题（只对外标法而言）随手动进样器的类型不同而异取决于以下各种情况：（1）如果使用全部定量环的手动进样器，在进样前需在“取样”（load）状态下清洗三次（2）如果使用部分定量环的手动进样器，进样量需少于定量环体积的50%（3）如果使用注射器的手动进样器，须确保进样操作重复（4）如果使用自动进样器可以确保正确的进样体积，须注射器不含空气，样品瓶有足够的样品，系统不泄漏（5）如果手动进样器，自动进样器都使用，应确保流路的平衡精密度下降峰积分为不正确参见上述“准确度下降”的故障排除方法进样问题参见上述“准确度下降”的故障排除方法样品预处理时样品降解或混入杂质参见上述“色谱图中出现多个鬼峰”的故障排除方法保留时间改变，峰形不正常参见上述“峰形不正常”的故障排除方法检测器响应故障参见上述“检测器”的故障排除方法表12-6泵的故障排除方法症状可能原因解决方法泵不工作（风扇不转，面板灯不亮）泵电源接不正确检查各种连线、电源是否正常保险线烧断换保险丝泵不能输送溶剂保险丝烧断抑保险丝泵与泵控制系统接不当正确连接泵低压限设置值高于操作压力设置正确的压力限压力传感器故障流速设置为零，调至压力传感器为零，修理/更换排放阀打开或泄漏关闭排放阀，如果溶剂继续泄漏，更换密封垫泵头溶剂水互溶用合适的溶剂冲洗泵，改用互溶性好的溶剂阀的时宜出口有脏物/失效清清洗密封垫圈损坏检查，如果溶剂是由泵头后部泄漏或有盐结晶析出表明柱塞密封垫损坏，换密封垫泵头有气穴现象（高压泵才有此现象）（1）溶剂贮液器位置等于/低于泵的位置抬高高溶剂贮液器位置（高于泵）（2）泵入口管路松，弯典或阻塞—检查管路，旋紧调直，更换（3）溶剂脱气不适当——脱气/充氧气（4）溶剂贮液器入口过滤器脏——清洗溶剂贮液瓶，清洗/更换溶剂入口过滤器，用6mol/L硝酸，水（重复三次），甲醇超声清洗过滤器（5）管路内径太细——使用正确的管路脉冲阻尼器/高压噪声过滤器问题检查泄漏处，更换脉冲阻尼器/高压噪声过滤器溶剂比例阀或混合器故障清洗比例阀或混合器，若问题仍存在，更换泵马达问题与供应商联系线路板问题与供应商联系泵头泄漏泵柱塞密封垫磨损更换泵柱塞磨损修理或更换泵头太松旋紧泵有关当局两螺丝，注意力量的均衡，不要过紧阀进出口太松旋紧（不要太紧）排放阀泄漏排放阀打开或损坏关闭排放阀，如溶剂继续泄漏，更换密封垫溶剂管路损坏更换流速不稳/泵脉冲溶剂脱气、通气保护不当溶剂脱气充氦气，重新平衡体系，注意氦气流量，避免带出流动相贮液器位置低/无溶剂抬高贮液器位置，加溶剂泵头有气泡排气泡，溶剂需脱气/通氦气，确保溶剂入口管路无气沟阀脏/失灵清洗阀，确认溶剂通过过滤器，无沉淀析出当使用水和有机溶剂混合流动相浓度达到50%或更高时，缓冲液在阀上析出沉淀，沉淀量取决于溶剂和缓冲液的比例溶剂入口过滤/入口管路阻塞检查管路，如需要更换清洗溶剂入口过滤砂芯，用6mol/L硝酸，水（重复三次），甲醇超声清洗过滤器溶剂比例阀或混合器故障清洗溶剂比例阀或混合器，如需要，更换泵柱塞密封垫漏（在泵头）更换泵柱塞磨损更换泵头溶剂不互溶参见上述“泵不能输送溶剂的故障排除方法”泵电路故障与供应商联系溶剂混合不当（梯度洗脱体系）泵头溶剂不互溶参见上述“泵不能输送溶剂的故障排除方法”溶剂比例阀或混合器故障清洗溶剂比例阀或混合器，如需要更换泵后溶剂混合问题参见上述“短期规则噪声”的故障排除方法泵系统压力高泵流量设备太高设置正确流量泵传感器故障流速设置为零，调至压力传感器为零，修理/更换出现不正常机械噪声泵密封垫干化如果适用，重新洗柱塞；清洗系统；用适当的溶剂通过泵头的路径湿润柱塞泵柱塞密封垫硬化更换密封垫子不合适更换液相色谱培培训讲义义(十五五)x

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发布布日期：：20007-55-222表12-7进样器的故障排除方法症状可能原因解决方法（一）手动进样器故障排除进样泄漏进样口问题调整/更换密封垫进样针规格与进样口不一（大或小）使用合适的注射器注射器问题（如弯曲或尖端起毛刺检查注射器，如果损坏更换，另外更换进样口密封垫进样器子泄漏旋转转子螺丝重新拧紧用专用工具旋转子螺丝（不要过紧）；如果继续泄漏，更换旋转转子表面磨损更换受压螺丝处泄漏零部件太松/紧检查接头与垫圈，如需要，更换样品进样问题（如进样困难，出现不正常峰形进样口阻塞或管路弯曲检查阻塞情况清洗进样器，如愿问题信用证存在，修理注射器问题（如弯曲或尖端起毛刺）检查阻塞情况，如有损坏更换，另外更换进样口密封垫旋转密封垫问题更换注射器堵塞清洗样品遣留样品定量环冲洗不当两次进样间用流动相冲洗样品定量环注射器脏或进样品脏使用清洁注射器，清洗进样口（二）自动进样器故障排除自动自进样器不能工作（风扇和前面板灯不亮）电源连接不正确，未与控制系统连接正确连接气压问题（气体驱动自动进样器确认空气压力管路的正确连接，检查原空气压力调节器，设置在适当的工作范围样品架问题与供应商联系电路问题与供应商联系流路系统泄漏（针、进样器、密封部件、流路部件受压配件太松/紧检查接头与垫圈，如需要，更换密封垫问题更换流路部件问题更换进样针损坏冲洗自动进样器针头，如问题继续存在，更换进样针件和密封垫洗针系统泄漏受压配件太松/紧检查接头与垫圈，如需要，更换流路阀问题更换洗针泵问题更换自动进样器从针头清洗