Zn2+和金属硫蛋白在细胞内表达的关系

Zn2+和金属硫蛋白在细胞内表达的关系

MRE：金属反应元件MT：金属硫蛋白apo-MT:金属硫蛋白前体物SH：巯基NLS：核定位序列PKC：蛋白激酶CMTF-1

:金属转录因子apo-MTF-1:无活性的金属转录因子JNK：c-Jun氮端激酶-TGCRCNC-：MRE核心区域共有序列主要英文缩写符号说明前言MT的结构Zn2+和MT在细胞内的表达Zn2+介导MT在细胞内表达的机制

结语参考文献报告内容一﹑前言所有组织和细胞大脑的神经元和神经胶质复层鳞状上皮细胞功能特异性MT-1,MT-2MT-3MT-4抵御金属离子的毒性和氧化应激参与神经细胞的生存以及轴突的形成表达角质素，促进上皮细胞的角质化参考文献：Andrews，1990；Toriumi等,2005；Quaife等，19941957年Margoshes,Vallee首次在马的肾脏中发现MT，到目前为止共发现170多种MT分子，包括MT-1～MT-4的四种基因类型。

（Sundar等，2006）研究对象研究内容资料来源鼠MT能够维持细胞内的锌离子稳态Cousins，1985小鼠日粮中锌的缺乏和过量均会引起机体MT的表达Kelly等，1996转基因小鼠会大量表达MT-1抑制日粮中锌的缺乏Dalton,1996饲喂锌缺乏日粮会影响老鼠胰脏的MT浓度和其mRNA的水平Palmitre等，1996Zn2+MT在细胞内表达

锌是动物必需的一种微量元素，它能与DNA或者其他蛋白质相互作用，在所有锌依赖的酶和组织蛋白中发挥重要的催化和结构功能（Gaither等，2001）.二﹑MT的结构MT一般是由60一68个氨基酸残基组成的多肽单链．分子中含有大量巯基，但不存在二硫键，在自然条件下，所有的巯基均与金属离子结合（Binz等，1999）．

分子量少于10，000Da；含有4-12个金属离子／分子；有丰富的Cys—X—Cys序列结构域；缺乏芳香族氨基酸，组氨酸含量极少．（资料来源：Meloni等，2006）图1老鼠四种MT亚型的氨基酸序列MT的一级结构MT的空间结构（资料来源：Maret等，2002)图2F/R探针的MT三维结构1MT整个分子呈哑铃形。由α和β两个大小相近的球形结构域组成。2两个结构域通过第30，31位的残基(铰链区)相连。MT分子中没有α-螺旋和β-折叠肽段，一分子的MT可以结合7个Zn或Cd(Michalska等，1996）。在MT分子中，每三个硫基与一个金属离子形成复合物（Hamor，1986)。图3老鼠MT-2分子的三维结构模型图（资料来源：Vasak，2005)图4脊椎动物和酵母中两种金属硫醇盐簇形式S三、Zn2+和MT在细胞内的表达研究对象研究内容研究结果资料来源鼠肾小管上皮细胞Zn2+刺激肾小管上皮细胞Harford，1991肝细胞Zn2+诱导老鼠肝细胞Hidalgo，1990神经瘤细胞Zn2+刺激老鼠神经瘤细胞Ebadi，1988人红细胞Zn2+刺激人的红细胞中MT含量变化Sullivan等，1998单核细胞Zn2+诱导人的单核细胞Mesna，1990；Sullivan等，1998外源性诱导细胞内锌浓度的升高是否也会引起MT的表达呢？？MT的mRNA在老鼠肝脏，肠道，肾脏的表达受到Zn2+的调节。（Blalock,1988)3.1外源性添加锌诱导MT的表达（资料来源：Jayasurya等,2000）图6细胞核中锌浓度与MT在细胞中表达的关系（资料来源：Tang等，2002）图5MT维持胞内Zn2+稳态模拟图MT是胞内数量最多的锌结合蛋白,对Zn2+有很高的亲和性，Zn-MT在基因表达和信号传递等过程中发挥重要作用（Satoh,等1999)。说明细胞中Zn2+浓度的升高能够引起MT的表达。3.2外源性诱导胞内Zn2+浓度升高引起MT的表达研究表明：细胞中加入外源性诱导剂，如NO,H2O2，重金属离子也会引起MT的表达，而这种诱导都是通过释放MT中的Zn2+实现。这几种外源性诱导剂诱导细胞内Zn2+浓度的升高，其作用方式是否相同？？图8外源性NO供体提供的NO与Zn2+均引起MT-1,MT-2的mRNA的表达（资料来源：Spahl，2003）Zn2+NONOZn2+图7iNOS衍生的NO引起鼠动脉上皮细胞中MT-1,MT-2的mRNA的表达MT-1MT-23.2.1NO诱导MT中的Zn2+释放引起MT的表达表明内源性和外源性NO均可以诱导细胞内MT的表达。（资料来源：Kroncke,1994)图9NO诱导马的肾上皮细胞MT中Zn2+的释放伴随着巯基的减少Zn-MT结构是半胱氨酸配基诱导MT氧化还原反应的化学基础（Maret,1998）表明NO破坏了Zn-S结构，使Zn2+从MT中释放出来进入胞质中。图10G75凝胶色谱仪分析老鼠肝脏上皮细胞胞质溶胶中加入Zn2+以及Zn2++DETA/NO后的MT中Zn2+变化(资料来源：Katakai等，2000)表明：NO置换了MT中的Zn2+，引起其中的Zn2+释放进入细胞质。？其他物质诱导MT表达是否也是通过释放MT中的锌实现的呢？图11H2O2诱导人的色素上皮细胞MT的表达（资料来源：Tate等，1995)3.2.2

H2O2诱导MT中Zn2+释放引起MT的表达细胞中MT以不含有Zn2+的apo-MT形式存在时，H2O2不能诱导MT基因的表达（Zhang等，2003）。说明H2O2诱导MT的表达对Zn2+可能具有依赖性。图13胞内铜浓度的改变对MT-1mRNA水平的影响（资料来源：Mcardle等，1990)说明Cu2+,Cd2+诱导MT在胞内的表达可能和Zn2+有关。3.2.3重金属离子诱导MT中的Zn2+引起MT的表达研究发现，使用apo-MT处理过量的Cu2+和Cd2+时，均不能诱导细胞中MT-1基因的表达(Zhang等，2003）。表明Cu2+,Cd2+诱导MT的表达，也是通过置换其中的Zn2+引起。（资料来源：Chiaverini，2010)图14老鼠肝脏Cd2+,Zn2+--MT-2三维结构ZnCd哺乳动物的MT主要结合胞内的Zn2+（Kagi，1991），在Cu2+和Cd2+过载的情况下，Zn2+可以被很容易的取代（Shaw等，1991）。细胞中的Zn2+是怎样诱导MT在胞内表达的呢？？以上研究表明：细胞中直接添加Zn2+或外源性诱导剂NO﹑H2O2和重金属离子均可以释放MT上的Zn2+，诱导MT自身的表达，所以Zn2+是MT表达的一个必需成分。四、Zn2+介导MT在细胞内表达的机制MTF-1是结合在MREs的功能区域发挥其作用（Koizumi，1999）图15MRE存在于MTF-1调节基因的临近启动子序列上（资料来源：Andrews，2001）MTF-1是Cys2-His2家族的一个锌指转录因子（Radtke，1993），也是基础条件和重金属诱导下，MT表达所必需的（Heuchel等，1994）MRE是一个12bp短序列，它是MTF-1在DNA序列上的一个结合点，金属离子的应答性反应依赖于MRE序列（Cizewski等，1989）。（资料来源：Smirnova,2001）图16蛋白质印迹和电泳分析Zn2+处理后，MTF-1在细胞核的蓄积和其活性形式的改变4.1Zn2+和MTF-1在胞质中的激活说明，Zn2+引起了MTF-1在细胞质中的激活过程，并且其激活过程是发生在MTF-1从细胞质向细胞核的核转运过程中。图17老鼠体内MTF-1的激活仅仅是Zn2+的作用(资料来源：Bittel等，1998）图18人胚肾细胞中，Zn7-MT的存在，促进MTF-1的激活（资料来源：Zhang等，2003）MTF-1表明MTF-1在胞内的激活过程是由Zn2+引起，其他金属离子诱导细胞质中MTF-1的激活也是依赖于其中的Zn2+的作用。？那么，Zn2+是怎样激活MTF-1的呢？老鼠MTF-1蛋白由675个氨基酸组成，包括一个含有6个Cys2-His2的锌指DNA结合区域（图b)和三个转录激活区域(图c)（Radtke等，1993），以及假定的核定位序列（NLS）和核输出序列（NES)(图a,c)(Saydam，2001)

（资料来源：Laity等，2007)图19老鼠MTF-1蛋白的主要区域结构MTF-1的区域结构图20MTF-1的锌指无序性（资料来源：Potter等，2005）这说明锌指F1-F6可能具有不同的功能性质。Chen（1998）CD分析MTF-1的F1-F6锌指结构发现其在222nm处具有相同的A值，而与Zn2+在其锌指半胱氨酸上的结合位置无关！图21MTF-1锌指缺失后与DNA结合的活性（资料来源：Bittel等，2000）图22缺失F1,F5,6后，MTF-1在酵母上的功能活性研究表明：存在两种锌依赖的激活MTF-1的现象。现象1：MTF-1的激活主要依赖于锌指F1,而不是F5,F6。图24缺失锌指F1，F5-6，MTF-1,短暂转染果蝇SL2细胞后的功能（资料来源：Bittel等，2000）图23缺失锌指F1，F5-6的MTF-1,短暂转染老鼠纤维母细胞（MTF-1-/-)后的功能说明锌指F1可能作为激活细胞质中的apo-MTF-1的一个功能锌指，而锌指F5,F6则是作为MTF-1的结构锌指，参与MTF-1的结构组成。资料来源：（Apuy等，2001）图26烷基化处理F1-F6中各个巯基后，各锌指中半胱氨酸残基的反应活性比率图25SDS分析MREd存在下，胰蛋白酶处理Zn6-MTF-1zf随时间的变化(资料来源：Chen等，1999)现象2：MTF-1的激活主要依赖于锌指F5,F6,而不是F1。说明MTF-1的锌指F5,F6对锌的亲和能力要强于锌指F1-F4.因此F5,F6可能是作为MTF-1的功能锌指，而F1-F4是作为结构锌指。（资料来源：Chen等，1998）模型A：Zn2+结合在弱Zn2+结合区域（F5,F6),导致分子内变构激活MTF-1。模型B：Zn2+与F1可逆的结合，消除阻碍F2-F4与F6相互作用的影响因素导致MTF-1的激活。图27：Zn2+激活MTF-1的两种模型：Zn2+激活MTF-1的两种模型：（资料来源：Stitt等，2006)图29MT敲出型小鼠肺上皮细胞中MTF-1的核转运数量降低（资料来源：Saydam等，2001）图28MTF-1的核转运有时间和浓度依赖性Zn2+能够加速MTF-1向细胞核的转运过程（Smirnova，2000）

？说明：Zn2+引起了MTF-1的核定位过程。4.2Zn2+和MTF-1的核定位（资料来源：Saydam等，2001)图31Zn2+诱导NLS突变体的MTF-1向细胞核内的运输被推迟图30人的MTF-1中NES和NLS序列（资料来源：Saydam,2001）F1图32老鼠纤维母细胞锌处理MTF-1的锌指F1缺失之后的核质MTF-1变化（资料来源：Bittel等，2000）表明：锌指F1单独存在可能并不影响MTF-1的核定位，MTF-1的核定位过程可能还依赖于其分子上其他功能区域的作用。Bitter(2000)研究发现，MTF-1中的锌指F1对于MTF-1与DNA的结合活性有很重要的作用，而不是F2-F6的作用。图33人的MTF-1的锌指F1-F3足够引起丙酮酸激酶（myc-pk)的核定位（资料来源：Lindert等，2009）表明：丙酮酸激酶（myc-pk)的核定位是依赖于MTF-1上面的NLS序列以及其锌指F1-F3共同的作用。图34人的MTF-1的氨基酸133-226序列是其核定位必须的（资料来源：Lindert等，2009）表明：人的MTF-1的氨基酸133-226序列是其核定位必须的，因此，MTF-1上的NLS序列和其锌指F1-F3一起作为MTF-1核定位的新的功能序列SNAIL1。资料来源：（Saydam，2001）图35各种应激处理的MTF-1转录激活4.3Zn2+和MTF-1的磷酸化？说明：MTF-1的核定位还不足以引起老鼠MT基因转录的发生。可能还存在其他方式影响了MTF-1的激活过程。MTF-1的活性可能和其磷酸化有关（Bittel，1998），其磷酸化发生在核转运过程中（Saydam，2002)，Zn2+能够诱导MTF-1的磷酸化（Adams，2000）资料来源：（LaRochelle，2001）图36MTF-1在猴的肾脏细胞中磷酸化（资料来源：Saydam，2002）图37MTF-1在人的肾脏细胞中磷酸化图38MTF-1在人胚肾细胞和老鼠的肾细胞中磷酸化（资料来源：Adams等，2002）说明：Zn2+诱导了MTF-1结构中的丝氨酸和苏氨酸富集区域的磷酸化，并且，细胞质中存在一定量磷酸化的MTF-1，Zn2+的加入，诱导了更多MTF-1的磷酸化。MTF-1的磷酸化与Zn2+诱导MT-1的表达有什么关系？？图39金属离子激活老鼠L细胞的JNK和PKC说明：Zn2+是通过激活PKC,PI3K,JNK三种激酶的活性，最后引起MT-1基因的表达。

图40PKC,PI3K,JNK酶的抑制剂处理老鼠L细胞中MT-1的mRNA分析（资料来源：LaRochelle，2001）PKCJNK(资料来源：Saydam等，2001）图41PKC抑制剂对Zn2+诱导的MT转录的影响说明：PKC的抑制剂可以抑制Zn2+诱导下，MT-1和MRE的表达，但是不抑制MT-1和MRE在细胞质中的基础水平的表达。表明：MTF-1的磷酸化是MT表达所必须的，其可能与Zn2+诱导MT-1表达过程中的PKC,JNK等几种酶的激活有关，而Zn2+是通过刺激MTF-1信号转导途径中的这几种激酶，最后引起MT基因的表达。图43PKC抑制剂对MTF-1与DNA结合的活性的影响（资料来源：Adams等，2002）资料来源：（LaRochelle，2001）图42PKC,JNK等酶缺乏的突变体小鼠抑制金属离子诱导的MT质粒MRE的表达（资料来源：Saydam等，2001）图45：PKC抑制剂对老鼠肾脏细胞中MTF-1磷酸化水平的影响图44：PKC抑制剂对老鼠肾脏细胞中MTF-1磷酸化水平的影响（资料来源：Adams等，2002）说明：Zn2+激活的MT基因的转录可能是受到去磷酸化的MTF-1的调节。可能原因是，Zn2+诱导磷酸化的MTF-1进入细胞核，而特异的残基去磷酸化，最后激活MT基因的转录。六﹑结语1.外源性添加Zn2+能够诱导细胞内MT的表达。2.外源性诱导剂NO，H2O2以及重金属离子诱导MT在细胞内的表达依赖于MT中Zn2+的作用。3.Zn2+诱导MT在细胞内的表达分为三个过程：第一，Zn2+与MTF-1的锌指结合；第二，Zn2+通过PKC等几种酶诱导MTF-1的磷酸化；第三，Zn2+介导活性的MTF-1进入细胞核，最后活性的MTF-1与MRE结合，启动MT的转录发生。七，参考文献Aravindakumar,C.T.,Ceulemans,J.,DeLey,M.,1999.NitricoxideinducesZn2+releasefrommetallothioneinbydestroyingzinc-sulphurclusterswithoutconcomitantformationofS-nitrosothiol.Biochem.J.344,253-258.Berendji,D.,KolbBachofen,V.,Meyer,K.L.,Grapenthin,O.,Weber,H.,Wahn,V.,Kroncke,K.D.,1997.Nitricoxidemediatesintracytoplasmicandintranuclearzincrelease.FEBSLett.405,37–41.Bittel,D.,Dalton,T.,Samson,S.L.-A.,Gedamu,L.,Andrews,G.K.,1998.TheDNAbindingactivityofmetalresponseelement-bindingtranscriptionfactor-1isactivatedinvivoandinvitrobyzinc,butnotbyothertransitionmetals.J.Biol.Chem.273,7127–7133.Chen,X.,M.Chu,andD.P.Giedroc.1999.MRE-bindingtranscriptionfactor-1:weakzinc-bindingfingerdomains5and6modulatethestructure,affinity,andspecificityofthemetal-responseelementcomplex.Biochemistry38:12915–12925.Dalton,T.P.,Li,Q.,Bittel,D.,Liang,L.,Andrews,G.K.,1996.Oxidativestressactivatesmetal-responsivetranscriptionfactor-1bindingactivity.J.Biol.Chem.271,26233–26241.Dalton,T.P.,Bittel,D.,Andrews,G.K.,1997.Reversibleactivationofmousemetalresponseelement-bindingtranscriptionfactor1DNAbindinginvolveszincinteractionwiththezincfingerdomain.Mol.Cell.Biol.17,2781–2789.Giedroc,D.P.,Chen,X.,Apuy,J.L.,2001.Metalresponseelement(MRE)-bindingtranscriptionfactor-1(MTF-1):structure,function,andregulation.Antioxid.RedoxSignal.3(4),577–596.Heuchel,R.,Radtke,F.,Georgiev,O.,Stark,G.,Aguet,M.,Schaffner,W.,1994.ThetranscriptionfactorMTF-1isessentialforbasalandheavymetal-inducedmetallothioneingeneexpression.EMBOJ.13,2870–2875.Kroncke,K.D,Fehsel,K.,Schmidt,T.,Zenke,F.T.,Dasting,I.,Wesener,J.R.,Bettermann,H.,Breunig,K.D.,Kolb-Bachofen,V,1994.Nitricoxidedestroyszinc-sulfurclustionofthefinger-typeyeasttranscriptionactivatorLAC9.Biochem.Biophys.Res.Commun.200,1105-1110.LaRochelle,O.,Gagne′,V.,Charron,J.,Soh,J.W.,Se′guin,C.,2001.Phosphorylationisinvolvedintheactivationofmetal-regulatorytran-scriptionfactor1inresponsetometalions.J.Biol.Chem.276(45),41879–41888.LaityJH,GKAndrews.Understandingthemechanismsofzinc-sensingbymetal-responseelementbindingtranscriptionfactor-1(MTF-1).BiolChem463(2007)201–210.Liu,S.X.,Fabisiak,J.P.,Tyurin,V.,Borisenko,G.G.,Pitt,B.R.,Lazo,J.S.,Kagan,V.E.,2001.Nitricoxide-dependentpro-oxidantandpro-apoptoticeffectofmetallothioneinsinHL-60cellschallengedwithcupricnitrilo-triacetate.Biochem.J.354,397–406.Li,Y.,T.Kimura,J.H.Laity,andG.K.Andrews.2006.Thezinc-sensingmechanismofmouseMTF-1involveslinkerpeptidesbetweenthezincfingers.Mol.Cell.Biol.26:5580–5587.MaretW.Oxidativemetalreleasefrommetallothioneinviazinc-thiol/disulfideinterchange.ProcNatlAcadSciUSA91:237–241,1994.MaretW,ValleeBL.Thiolateligandsinmetallothioneinconferredoxactivityonzincclusters.ProcNatlAcadSciUSA1998;95:3478–82.PearceLL,GandleyRE,HanW,WasserloosK,StittM,KanaiAJ,McLaughlinMK,PittBR,andLevitanES.Roleofmetallothioneininnitricoxidesignalingasrevealedbyagreenfluorescentfusionprotein.ProcMaltAcadSciUSA97:477-482,2000.Radtke,F.,Heuchel,R.,Georgiev,O.,Hergersberg,M.,Gariglio,M.,Dembic,Z.,Schaffner,W.,1993.ClonedtranscriptionfactorMTF-1activatesthemousemetallothioneinIpromoter.EMBOJ.12,1355–1362.Saydam,N.,Geo