生物化学与分子生物学第十四章DNA的生物合成(复制)

遗传信息传递第三篇中心法则(TheCentralDogma)转录翻译逆转录复制DNARNA蛋白质——

储存和传递遗传信息蛋白质核酸——

构成生物体的基本组分，执行各种生理功能DNA的生物合成(复制)DNABiosynthesis，Replication

第十四章DNA复制DNAReplication

第一节本节主要内容：

复制的基本特征参与DNA复制的酶及蛋白质因子复制的过程复制(replication)

是指遗传物质的传代，以母链DNA为模板合成子链DNA的过程。复制亲代DNA子代DNA复制的方式

——半保留复制(semi-conservativereplication)双向复制(bidirectionalreplication)半不连续复制(semi-discontinuousreplication)一、复制的主要特征（一）DNA以半保留方式进行复制DNA生物合成时，母链DNA解开为两股单链，各自作为模板(template)按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。子代细胞的DNA，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全从新合成。两个子细胞的DNA都和亲代DNA碱基序列一致。这种复制方式称为半保留复制。半保留复制的概念子链继承母链遗传信息的几种可能方式：

全保留式半保留式混合式密度梯度实验

——实验结果支持半保留复制的设想。含重氮-DNA的细菌培养于普通培养液

第一代继续培养于普通培养液

第二代梯度离心结果按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。半保留复制的意义：遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。原核生物基因组是环状DNA，只有一个复制起点（origin）。复制从起点开始，向两个方向进行解链，进行的是单点起始双向复制。（二）DNA复制从起点向两个方向延伸复制中的放射自显影图象AGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGACAGGTACTGAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+母链DNA

复制过程中形成的复制叉子代DNA

复制中的模板DNA形成两个延伸方向相反的开链区称为复制叉。指复制时，双链DNA分子所形成的Y字形结构，其中已解旋的两条模板单链以及正在进行合成的新链构成了Y型头部，尚未解旋的DNA模板双链构成了Y型的尾部。复制叉的定义A.环状双链DNA及复制起始点B.复制中的两个复制叉C.复制接近终止点(termination,ter)oriterABC.真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子的复制。从一个DNA复制起始点起始的DNA复制区域定为一个复制子(replicon)。复制子是独立完成复制的功能单位。5’3’oriorioriori5’3’5’3’oriorioriori5’3’5’5’3’3’5’5’3’复制3’（三）复制的半不连续性3535解链方向3´5´3´3´5´领头链(leadingstrand)随从链(laggingstrand)顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，这股链称为领头链。另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称为随从链。复制中的不连续片段称为岡崎片段(okazakifragment)。

领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的半不连续性。

二、参与DNA复制的酶及蛋白质Enzyme

and

ProteinsinvolvedinDNAReplication参与DNA复制的物质：底物(substrate):

dATP,dGTP,dCTP,dTTP聚合酶(polymerase):

依赖DNA的DNA聚合酶，简写为DNA-pol模板(template):

解开成单链的DNA母链引物(primer):

提供3-OH末端使dNTP可以依次聚合

其他的酶和蛋白质因子核苷酸和核苷酸之间生成磷酸二酯键是复制的基本化学反应(dNMP)n

+dNTP→(dNMP)n+1

+PPi聚合反应的特点：DNA新链生成需引物和模板；新链的延长只可沿5→3方向进行。DNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把DNA解成单链，它才能起模板作用。

(一)解螺旋酶和单链DNA结合蛋白

多种酶参与DNA解链和稳定单链状态E.Coli基因图解螺旋酶(helicase)

——利用ATP供能，作用于氢键，使DNA双链解开成为两条单链单链DNA结合蛋白(singlestrandedDNAbindingprotein,SSB)——在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整

（二）DNA聚合酶全称：依赖DNA的DNA聚合酶（DNA-dependentDNApolymerase）简称：DNA-pol活性：1.53

的聚合活性

2.核酸外切酶活性5´AGCTTCAGGATA

3´

|||||||||||3´TCGAAGTCCTAGCGAC5´35外切酶活性53外切酶活性?能切除突变的DNA片段。能辨认错配的碱基对，并将其水解。

核酸外切酶活性DNA聚合酶催化反应的特点：1、四种脱氧核苷三磷酸为底物；2、反应需要模板的指导；3、反应需要有引物且3′端有自由的羟基；4、新生DNA链的延伸方向为5′→3′；5、新生DNA链与模板链之间遵循碱基互补原则。1、原核生物的DNA聚合酶DNA-polⅠDNA-polⅡDNA-polⅢ功能：对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补。DNA-polⅠ（109kD）323个氨基酸小片段5核酸外切酶活性大片段/Klenow片段

604个氨基酸DNA聚合酶活性

5核酸外切酶活性N端C端木瓜蛋白酶DNA-polⅠKlenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。

DNA-polⅡ（120kD）DNA-polII基因发生突变，细菌依然能存活。DNA-polⅡ对模板的特异性不高，即使在已发生损伤的DNA模板上，它也能催化核苷酸聚合。因此认为，它参与DNA损伤的应急状态修复。功能：是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。

DNA-polⅢ(250kD)２个核心酶1个-复合物（、、、、、

6种亚基）1对-亚基（可滑动的DNA夹子）DNA聚合酶Ⅲ全酶结构全酶结构包括：亚基（130000）主要功能是合成DNA亚基具有35外切酶活性（复制保真性所必需）亚基可增强其活性亚基可能起组装作用核心酶由、和亚基组成：两侧的β亚基发挥夹稳DNA模板链，并使酶沿模板滑动的作用2个-亚基分别和1个核心酶相互作用，其柔性连接区可以确保在复制叉1个全酶分子的2个核心酶能够相对独立运动，分别负责合成前导链和后随链。功能：有促进全酶组装至模板上及增强核心酶活性的作用-复合物由6种亚基组成：、、、、、2、真核生物的DNA聚合酶DNA-pol起始引发，有引物酶活性。延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。参与低保真度的复制。在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。在线粒体DNA复制中起催化作用。DNA-polDNA-polDNA-polDNA-pol1.遵守严格的碱基配对规律；2.聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能；3.复制出错时DNA-pol的及时校读功能。DNA复制的保真性至少要依赖三种机制：

引物酶(primase)——复制起始时催化生成RNA引物的酶（三）引物酶(primase)和DNA连接酶(DNAligase)连接DNA链3-OH末端和相邻DNA链5-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链。DNA连接酶(DNAligase)作用方式：HO5’3’3’5’DNA连接酶ATPADP5’3’5’3’DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。也是基因工程的重要工具酶之一。功能：108

局部解链后（四）DNA拓扑异构酶(DNAtopoisomerase)

解链过程中正超螺旋的形成拓扑异构酶作用特点：

既能水解、又能连接磷酸二酯键

拓扑异构酶Ⅰ

拓扑异构酶Ⅱ分类：拓扑异构酶Ⅰ

切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，DNA变为松弛状态（负超螺旋）。反应不需ATP。拓扑异构酶Ⅱ

切断DNA分子两股链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。利用ATP供能，连接断端，DNA分子进入负超螺旋状态。作用机制：

拓扑异构酶Ⅱ作用机制：三、DNA复制的过程TheProcessofDNAReplication起始是复制中较为复杂的环节，在此过程中，各种酶和蛋白因子在复制起始点处装配引发体，形成复制叉并合成RNA引物。

需要解决两个问题：1.DNA解开成单链，提供模板。2.形成引发体，合成引物，提供3-OH末端。（一）原核生物复制的起始E.coli复制起始点oriCGATTNTTTATTT···GATCTNTTNTATT···GATCTCTTATTAG···11317293244···TGTGGATTA-‖-TTATACACA-‖-TTTGGATAA-‖-TTATCCACA5866166174201209237245

串联重复序列

反向重复序列53531、DNA解链原核生物的复制起始部位及解链

DnaADnaB、DnaCDNA拓扑异构酶引物酶SSB35352、引物合成和引发体形成含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。3535引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。引物3'HO5'引物酶引发体和复制叉的生成

（二）原核复制的延长复制的延长指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。

5'3'5'dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH3'3'DNA-pol领头链的合成：领头链的子链沿着5→3方向可以连续地延长。后随链的合成

在复制叉同时合成前导链和后随链复制过程简图原核生物基因组是环状DNA，双向复制的复制片段在复制的终止点(ter)处汇合。oriter

E.coli8232oriterSV40500（三）原核复制的终止5`5`5`RNA酶OHP5`DNA-polⅠdNTP5`5`PATPADP+Pi5`5`DNA连接酶

随从链上不连续性片段的连接逆转录和端粒ReverseTranscription&telomere

第二节逆转录酶(reversetranscriptase)逆转录(reversetranscription)RNADNA

逆转录酶一、逆转录病毒和逆转录酶

逆转录病毒细胞内的逆转录现象：RNA模板逆转录酶DNA-RNA杂化双链RNA酶单链DNA逆转录酶双链DNA逆转录酶

AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ碱水解

TTTT分子生物学研究可应用逆转录酶，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一，此法称为cDNA法。

以mRNA为模板，经逆转录合成的与mRNA碱基序列互补的DNA链。试管内合成cDNA：cDNAcomplementaryDNA二、逆转录研究的意义

逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中的重大发现。

逆转录现象说明：至少在某些生物，RNA同样兼有遗传信息传代与表达功能。对逆转录病毒的研究，拓宽了20世纪初已注意到的病毒致癌理论。

染色体DNA呈线状，复制在末端停止。复制中岡崎片段的连接，复制子之间的连接。染色体两端DNA子链上最后复制的RNA引物，去除后留下空隙。三、端粒(telomere)53355335+5333355端粒(telomere)

指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构。功能：•维持染色体的稳定性•维持DNA复制的完整性结构特点：•由末端单链DNA序列和蛋白质构成。•末端DNA序列是多次重复的富含T、G碱基的短序列。TTTTGGGGTTTTGGGG…端粒酶(telomerase)端粒酶RNA(humantelomeraseRNA,hTR)端粒酶协同蛋白(humantelomeraseassociatedprotein1,hTP1)端粒酶逆转录酶(humantelomerasereversetranscriptase,hTRT)

组成：端粒酶的催化延长作用爬行模型DNA聚合酶复制子链进一步加工DNA损伤（突变）与修复DNADamage(Mutation)&Repair第三节

遗传物质的结构改变而引起的遗传信息改变，均可称为突变，又称为DNA损伤(DNAdamage)。

从分子水平来看，突变就是DNA分子上碱基的改变。

DNA损伤

遗传物质的结构改变而引起的遗传信息改变，均可称为突变。这种改变可以是在某种化学物质的攻击下导致的损伤，也可以是在复制过程中的错配未被体内修复系统发现和修复一、DNA损伤（一）定义：(二)突变的分类点突变(mismatch)缺失(deletion)插入(insertion)重排(rearrangement)

框移(frame-shift)

DNA分子上的碱基置换称点突变(pointmutation)。发生在同型碱基之间，即嘌呤代替另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。1.转换发生在异型碱基之间，即嘌呤变嘧啶或嘧啶变嘌呤。

2.颠换1.点突变镰形红细贫血病人Hb(HbS)β亚基N-val

·

his

·

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·

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·

pro·

val

·

glu

·

·

·

·

·

·

C肽链CACGTG基因正常成人Hb(HbA)β亚基N-val

·

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·

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·

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·

pro·

glu

·

glu

·

·

·

·

·

·

C肽链CTCGAG基因2.缺失、插入和框移缺失：一个碱基或一段核苷酸链从DNA大分子上消失。插入：原来没有的一个碱基或一段核苷酸链插入到DNA大分子中间。框移突变是指三联体密码的阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变。

缺失或插入都可导致框移突变

。谷酪蛋丝5’……GCA

GUA

CAU

GUC……丙缬组缬正常5’……GAG

UAC

AUG

UC……缺失C缺失引起框移突变3.重排DNA分子内较大片段的交换，称为重组或重排。

由基因重排引起的两种地中海贫血基因型（三）引发突变的因素1.自发突变

DNA复制过程中DNA聚合酶催化聚合反应出错的概率为百万分之一。2.物理因素：紫外线(ultraviolet,UV)、各种辐射

UV3.化学因素：4.病毒因素如：某些RNA病毒。

二、DNA损伤的修复修复(repairing)是对已发生分子改变的补偿措施，使其回复为原有的天然状态。1、直接修复方式光修复酶

UVUvrAUvrBUvrCOHPDNA聚合酶ⅠOHP

2、切除修复

是细胞内最重要的修复机制，主要由核酸内切酶、DNA聚合酶Ⅰ和连接酶完成。（excissionrepairing）DNA连接酶ATPE.coli的切除修复机制3、丢失碱基和去碱基部位的修复

胞嘧啶脱氨变为尿嘧啶、腺嘌呤脱氨变成次黄嘌呤时，DNA糖苷酶（DNAglycosylase）切除不正常的碱基，留下无碱基的部位，这个部位会与邻近的多核苷酸链一起被去除，DNAPOl1和连接酶将这部分修复。4、甲基化指导的不配对修复

DNA合成时，当错误碱基掺入新链时，大肠杆菌中有一种甲基化酶能使模板链的腺苷酸甲基化，而不使正在合成的新链中的腺苷酸甲基化，MutS蛋白识别错配碱基，在MutL蛋白和MutH蛋白的参与下，切除无甲基化链上错配碱基部分的一段核苷酸链。DNA聚合酶Ⅲ催化合成DNA新链取代切除的新链，连接酶将切口连接。此过程需解链酶、SSB和核酸外切酶的参与。三、单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)

由单个碱基的变化引起的一种序列变化。即在某一个位点上,可有两种或两种以上的不同核苷酸。单核苷酸多态性的概念

SNP是人类基因组中最多的一种DNA多态性,遍布整个人类基因组,平均1000bp就有一个SNP,总数可达300万个。两个不同的个体之间约有几百万个碱基的差别,可作为第三代DNA遗传标记。由于这一类标记的基础是各种形式的单碱基突变,理论上用于单碱基突变或多态性的技术都可用于SNP标记的检测,如RFL