基因组学物理图绘制

关于基因组学物理图绘制第1页，共40页，2022年，5月20日，6点3分，星期四遗传图的缺点遗传图的分辨率有限

基因组测序和组装所要求的标记密度是100kb。遗传图的覆盖面较低

重组热点，倒位区段遗传图分子标记的排列有时会出现差错

环境因素，取样误差第2页，共40页，2022年，5月20日，6点3分，星期四物理作图的方法

限制酶作图(RestrictionMapping)

依靠克隆的基因组作图(clone-basedmapping)

荧光原位杂交(Fish,Fluorescentinsituhybridization)

序列标签位点作图(STS，Sequencetagedsite)第3页，共40页，2022年，5月20日，6点3分，星期四1.限制性作图

它是将限制性酶切位点标定在DNA分子的相对位置.

其只能应用于较小的DNA分子,其上限取决于作图分子中限制酶位点的频率.

通常采用的6碱基对识别顺序的限制酶仅适合50Kb以下DNA分子的精确作图.第4页，共40页，2022年，5月20日，6点3分，星期四1.1限制酶作图(RestrictionMapping)基本原理1KbEcoRI待检的DNABamHI15Kb6Kb5Kb10Kb9KbEBBHHEHHHHE+BEB6KbEH4KbEB5KbBH第5页，共40页，2022年，5月20日，6点3分，星期四琼脂糖电泳第6页，共40页，2022年，5月20日，6点3分，星期四用于小片段DNA的分析，精度非常高聚丙烯酰胺凝胶电泳第7页，共40页，2022年，5月20日，6点3分，星期四1.2限制酶作图的改进脉冲凝胶电泳(pulsed-fieldgelelectrophoresis)稀有切点限制图绘制垂直交变电场,两个电场方向成为直角一般的凝胶电泳30Kb以下，脉冲凝胶是提高了2个数量级，达到10MbDNA片段>50Kb第8页，共40页，2022年，5月20日，6点3分，星期四稀有切点限制图绘制注意事项:

识别序列越长产生的片段越大;识别位点碱基数预计DNA片段平均长度/Kb41648641010004的n次方，n是限制酶识别的碱基数第9页，共40页，2022年，5月20日，6点3分，星期四

识别位点碱基的组成影响限制性片段的大小;

如人类基因组A/T比例接近60/%,选用高比例A/T位点限制酶,产生的片段多于高比例G/C识别位点酶特异序列含量高，否则效果不好第10页，共40页，2022年，5月20日，6点3分，星期四

有些限制酶识别位点较长如酵母的Ⅰ-SceI识别顺序为18bp,TAGGGATAA/CAGGGTAAT

如果高等真核生物基因组中无此序列,可通过转座子转座和噬菌体转导的方法将其引入待测基因组中.第11页，共40页，2022年，5月20日，6点3分，星期四基因组DNA的甲基化状态

如人类活细胞基因组中大量5’-CG-3’顺序的胞嘧啶被甲基化,形成5’-TG-3’，使许多含有5’-CG-3’顺序的内切酶很少找到可切位点.SmaICCC/GGG78kbNotIGC/GCGCGC1Mb第12页，共40页，2022年，5月20日，6点3分，星期四凝胶浓度、电场强度、缓冲液第13页，共40页，2022年，5月20日，6点3分，星期四采用定时改变电场方向的交变电源，每次电流方向改变后持续1s到5min左右，然后再改变电流方向，反复循环，所以称之为脉冲式交变电场。脉冲凝胶电泳(PFGE)(pulsed-fieldgelelectrophoresis)分离范围：分子量20kb—5000kb第14页，共40页，2022年，5月20日，6点3分，星期四分辨力：10MB垂直交变电场,两个电场方向成为直角30Kb10MbDNA片段>50Kb1984年，Schwartz和Centor发明了交变脉冲场凝胶电泳(pulsed-fieldgelelectrophoresis，PFGE)技术，与常规的直流单向电场凝胶电泳不同，这项技术采用定时改变电场方向的交变电源，每次电流方向改变后持续1s到5min左右，然后再改变电流方向，反复循环，所以称之为脉冲式交变电场。

一、PFGE的基本原理

脉冲电泳分离DNA大分子的介质是琼脂糖，大于20kb的线性DNA双链片段，在琼脂糖凝胶的网孔中的泳动，就像蛇行似的寻找弯曲蜿蜒的孔隙。普通的单方向恒定电场给DNA分子的泳动动力方向确定且不发生变化，所以严重影响凝胶电泳分离大分子量DNA片段的效果。

PFGE施加在凝胶上至少有两个电场方向，时间与电流大小也交替改变，使得DNA分子能够不断地调整泳动方向，以适应凝胶中不规则的孔隙变化，达到分离大分子线性DNA的目的，最大分辨率为5000kb大小的线性DNA分子。在交变脉冲电场中，大分子量线性DNA改变泳动方向所需时间比小分子线性DNA要长，因为前者变形能力低于后者。当某一线性DNA在脉冲场中改变形状调整方向进行迁移所需的时间大于脉冲场脉冲维持时间时，该DNA的迁移速度将减为最低。线性分子改变形状和泳动方向所需时间与其分子量大致成正比，PFGE也是基于不同DNA分子量的差异作为分离不同DNA分子的依据。当DNA分子变形转向所需时间与脉冲时间较接近时，迁移率与DNA分子量成反比。根据被分离DNA分子的范围选择适当的脉冲时间，经过较长时间不断变形转向泳动，不同大小的DNA就被分离。DNA分子的净迁移方向与普通电泳一样，垂直于样品孔。

影响PFGE分辨率的因素包括几方面：两个脉冲场的均一性；两个脉冲场的脉冲时间以及它们之间的比率；两个脉冲场的强度和方向。为了增强PFGE对大小差异较大的DNA样品的分辨率，可采用交变脉冲梯度电场，即在电泳过程中，先用较短的交变脉冲时间使较小的DNA分子分离，然后用较长的交变脉冲时间分离较大的DNA分子。第15页，共40页，2022年，5月20日，6点3分，星期四端粒自主复制起始点标记基因标记基因着丝粒大肠杆菌质粒复制起始点质粒扩增筛选标记2.1大片段DNA的克隆载体克隆位点第16页，共40页，2022年，5月20日，6点3分，星期四YAC插入子稳定性问题,同一酵母细胞中多个YAC引起交换产生嵌合顺序PBR322人工改造而来色氨酸、鸟苷酸筛选，TRP和URAnium，基本培养基上筛选是否有这两个臂的基因。SUP确定是否有插入片段，插入时，红色克隆，无克隆时显示白色11.4kb着丝粒负责细胞分裂时染色体均等分配端粒：保持人工染色体的稳定性。自主复制起点：细胞染色体复制的启动第17页，共40页，2022年，5月20日，6点3分，星期四缺点插入子不稳定交换效应GC区克隆效率低

标准的YAC操作程序克隆的DNA平均为600kb，改进的程序可获得1400kb第18页，共40页，2022年，5月20日，6点3分，星期四230kb-1700kb标准操作为600kb，改进的1400kb插入子不稳定交换效应嵌合序列GC区克隆效率低人类基因组中第19页，共40页，2022年，5月20日，6点3分，星期四BAC:细菌人工染色体300Kb1992与一般质粒有2点不同:单拷贝复制(不会发生重组嵌合)相对分子量大(具有较大容量)介导F因子单向复制维持低水平质粒拷贝数第20页，共40页，2022年，5月20日，6点3分，星期四BAC来源于大肠杆菌中的天然F质粒,与一般质粒有2点不同:单拷贝复制(不会发生重组嵌合),相对分子量大(具有较大容量),类似于制备质粒方法提取质粒,方便快捷Cm氯霉素Loxp蛋白作用位点，可将环状DNA转变为线性DNA，p1Cre蛋白作用位点CosN伽马噬菌体末端酶专一性切割位点第21页，共40页，2022年，5月20日，6点3分，星期四2.2重叠群组建重叠群:相互重叠的DNA片段组成的物理图.重叠群的组建方法染色体步移法第22页，共40页，2022年，5月20日，6点3分，星期四

指纹:系指确定DNA样品所具有的DNA片段;

一个克隆的指纹表示了该克隆所具有的限定的顺序特征.2.3指纹作图法第23页，共40页，2022年，5月20日，6点3分，星期四常用的指纹分析方法:

A

限制性带型(restrictionpatterns)指纹

B

重复序列DNA指纹(repetitiveDNAfingerprints)第24页，共40页，2022年，5月20日，6点3分，星期四Southern

印迹法DNA分子限制片段限制性酶切割琼脂糖电泳转移至硝酸纤维素膜上与放射性标记DNA探针杂交放射自显影带有DNA片段的凝胶凝胶滤膜用缓冲液转移DNA吸附有DNA片段的膜第25页，共40页，2022年，5月20日，6点3分，星期四常用的指纹分析方法:C

重复DNAPCR(repetitiveDNAPCR)或分散重复序列PCR(interspersedrepeatelementPCR,IRE-PCR)指纹DSTS作图(STScontentmapping)第26页，共40页，2022年，5月20日，6点3分，星期四AluPCR方法特点在于利用人DNA中普遍存在的Alu重复序列，这种300bp序列的拷贝约900.000个，分布于整个人基因组。虽然Alu重复序列各拷贝间有很大差别，但已确定出了一个相同序列，且重复子中一些区域是极为保守的。我们认为，可设计合适的能识别这些保守区的PCR引物，进行有效的内-Alu扩增，从复杂源中分离人DNA。平均密度4kb第27页，共40页，2022年，5月20日，6点3分，星期四第28页，共40页，2022年，5月20日，6点3分，星期四3.荧光原位杂交(Fish,Fluorescentinsituhybridization)

将探针用荧光标记，与细胞分裂中期的染色体杂交，用荧光显微镜观察信号所处的位置，将探针标定在连锁图上。第29页，共40页，2022年，5月20日，6点3分，星期四分辨率低,敏感性低精细作图对于特定探针,原位杂交所显示的中期染色体荧光信号所处的位置与染色体短臂末端的相对距离不变,经标记可将其标定在连锁图上.分辨力达到25Kb,染色体无法确定外部形态第30页，共40页，2022年，5月20日，6点3分，星期四限制性作图快速，但是不适合大基因组克隆重叠群构建程序复杂，费时费力指纹作图对于大基因组有不少问题，会出现误排原位杂交操作困难，资料积累慢，一次实验定位的分子标记3-4个，第31页，共40页，2022年，5月20日，6点3分，星期四4.序列标签位点作图

(STS,SequenceTagedSite)长度:100-500bp序列已知,可以设计PCR反应单拷贝,在染色体上的位置是唯一的EST(Expressedsequencetag)大部分可以作STS第32页，共40页，2022年，5月20日，6点3分，星期四4.1STS作图原理与遗传作图的相似，都是频率决定远近，是断裂频率第33页，共40页，2022年，5月20日，6点3分，星期四4.2寻找STS的方法:表达顺序标签(expressedsequencetag，EST)

从cDNA中找到的小段顺序,但基因家族成员间共有的序列不能用于STS。SSLP（simplesequencelengthpolymorphisrns，SSLPs）简单序列长度多态性随机基因组顺序第34页，共40页，2022年，5月20日，6点3分，星期四随机挑选cDNA克隆进行单向、一步大规模测序，将所获得的部分cDNA序列称为ＥＳＴ。

EST是一个cDNA克隆快速大规模测序后所获得的３’端和５’端部分cDNA随机片段，每个EST长度约200～600bp,代表了一个单拷贝基因的部分cDNA表达序列。由于大多数ＥＳＴ的长度不足400bp,说明一个基因转录本的cDNA序列可能包含多个序列重叠的EST，由于一个基因mRNA剪接点不同可以获得多个cDNA克隆，因此EST既可能对应于一个cDNA的某一部分，又可能代表mRNA的不同剪接方式

。任何单一DNA顺序都可作为STS，特别是已在连锁分析中（遗传图中）定位的SSLP，其可建立物理图与遗传图之间的联系。第35页，共40页，2022年，5月20日，6点3分，星期四ESTEST是一个cDNA克隆快速大规模测序后所获得的3’端和5’