四种提取花生DNA的方法

蚈氯化钠法：取3mL精练棉子油,加入 3mL正己烷,芆加入3mLNaCl(1.4mol#L-1),继续于旋转搅拌器上振荡混合1h;12000r#min-1离心20min,使有机相和水相分离,小心取出下层水相;加入与水相溶液等体积的异丙醇,轻缓颠倒混匀,室温放置40min后,12000r/min-1离心20min,弃上清液,保留沉淀;待沉淀稍微干燥后用1mLTE溶解沉淀,加入1mL异丙醇,轻缓颠倒混匀,室温放置10min，后,12000r#min-1离心20min,弃上清液,保留沉淀;待沉淀稍微干燥后加入60LLTE,充分溶解沉淀,2min过后generaybiotech琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(离心柱型)GK204150次(仅进行纯化部分),最后将离心获得的溶液(经核酸蛋白浓度检测仪检测浓度)取5微升进行琼脂糖凝胶电泳,同时可作为PCR反应的模板[5-6]。建议一个PCR反应使用1微升DNA。螁纯化部分： 1．从琼脂糖凝胶中切下含有目的片段的凝胶，估计重量羀或精确称量重量。膆2．每 100mg琼脂糖凝胶加入 100μlBindingSolution ，肅于50～60℃水浴 3～5min，期间每 2～3min间断轻微袁颠倒混匀，直至胶块完全融化。莁注：为操作方便，可统一加入 400μlBindingSolution。袇3．将上述混合液转移至套有 2ml收集管的吸附柱 GC-3u袄中，室温放置 2min，6,000rpm室温离心 1min，取出羁吸附柱 GC-3u，并倒掉收集管中废液。薇4．将将吸附柱 GC-3u重新放回收集管中，加入 500μlWA芅Solution，于 12,000rpm，室温离心 1min，倒掉收集管薂中废液。羁5．将吸附柱 GC-3u重新放回收集管中，加入 500μlWash羈Solution，于 12,000rpm，室温离心 1min，倒掉收集管肇中废液。蚅6．重复步骤

5一次。肁7．将吸附柱

GC-3u

重新放回收集管中，

12,000rpm，室荿温离心

1min，之后，打开吸附柱

GC-3u

的盖子，室温蒅放置5～10min或50℃放置3～5min，以彻底去除 Wash莄Solution。膁8．将吸附柱GC-3u放入干净的1.5ml收集管中(用户自螀备)，对膜中央悬空加入 25～30μlElutionBuffer，盖膇好盖子，37℃放置 2min，12,000rpm离心 1min，离膃心管中的液体即为包含目的 DNA 片段的溶液。芀PBS和正己烷法：取500ml精炼大豆油加入500ml正己烷，在磁力搅拌器中充分混匀，4h；加入1000mlPBS缓冲溶液在磁力搅拌器中充分混匀，6h；12000×g离心20min，小心取出下层水相；加入(NH)4SO4沉淀过夜。12000×g离心20min，保留沉淀；在沉淀膁中加入800μlH2O, 充分溶解沉淀后，加入等体积的酚和氯仿抽提， 12000×g离心10min，取上清，加入二倍体积的无水乙醇，4℃20min，12000×g离心10min，保留沉淀，自然风干后，加入50μl水溶解沉淀，电泳定量。蚅SDS法：待检样品的制备[2]在1.5mLEP管中加入1mL食用油及400μLTE缓冲液，颠倒混匀5min，室温下离心 13000r/min3min，去除上层油脂层；再次向同一支管中加入 1mL膆食用油，颠倒混匀，离心，去除上层油脂层，反复

20次。取水相用于提取

DNA

。莀A．

400LTE缓冲液中加入

1mL棉籽油，上下颠倒混匀

5min，离心3min;

去上层油脂

;重复20次，得约 400L水相;B．水相中加入 200L20%SDS，水浴;C．加入100L5mol/LNaAc，轻轻摇匀，冰上放置 30min，离心10min;D．将上清移至新离心管，加入 1g担体等体积无水乙醇和 0．1倍体积3mol/LNaAc(pH5．2)，颠倒混匀后，－ 20℃放置2h;离心，弃上清;E．沉淀用500L70%乙醇洗涤两次，干燥15min;F．加入30L0．1×TE。芈SDS法也是一种分子生物学中常用的DNA提取方法。与CTAB不同，SDS是一种阴离子去垢剂，在高温条件下能裂解细胞，使染色体离析、蛋白变性，同时及多糖结合成复合物，释放出核酸。通过提高盐浓度并降低温度，使

SDS能与蛋白质SDS-蛋白质复合物的溶解度变得更小DNA。传统的

，从而使蛋白质及多糖杂质沉淀。上清液经酚SDS提取缓冲液，包含 Tris-HCl，EDTA，

/氯仿反复抽提后用乙醇沉淀莇NaCl，巯基乙醇和 SDS［23］。羅CTAB法：待检样品的制备[2]在1.5mLEP管中加入1mL食用油及400μLTE缓冲液，颠倒混匀 5min，室温下离心 13000r/min3min，去除上层油脂层；再次向同一支管中加入 1mL蒀食用油，颠倒混匀，离心，去除上层油脂层，反复

20次。取水相用于提取

DNA

。虿在制样获取的水相中，加入 400μLCTAB提取液漩涡振荡 1s~3s，置于65℃水浴30min；加入等体积。三氯甲烷 /异戊醇（24:1），轻缓颠倒数次后室温静置 5min；13000r/m室温下离心5min，转移并等分上清液于两个 1.5mL离心管；加入 0.6倍体积预冷的异丙醇，颠倒混匀后于-20℃静置过夜沉淀 DNA；13000r/min室温离心 10min，弃去上清液；用 70%乙醇洗涤沉淀两次，干燥沉淀物（注意不应过于干燥，否则沉淀难溶解） ；每个离心管中加入 30μL~50μLTE

缓冲液溶解沉淀，

4℃保存备用。聿CTAB 法被广泛的应用于植物叶子、 种子、微生物以及加工食品中的 DNA 提取，是一种经典的 DNA提取方法［14－15］。其基本原理是 :CTAB 是一种阳离子去污剂，它能与核酸形成复合物，这些复合物在 低盐溶液中因溶解度的降低而沉淀 ，而在高盐溶液中可螄解离，从而使 DNA 与多糖等杂质分开， 再用乙醇沉淀 DNA 而除去 CTAB。自从 Murray等人［16－17］首次使用 CTAB 法成功的提取植物基因组 DNA，CTAB 发展迅速，不断得到改进，已经成为分子生物学中提取 DNA 的最常用的方法之一［ 18－20］。以下无正文仅供个人用于学习、研究；不得用于商业用途。Forpersonaluseonlyinstudyandresearch;notforcommercialuse.仅供个人用于学习、研究；不得用于商业用途。Nurfürdenpers?nlichenf ürStudien,Forschung,zukommerziellenZweckenverwendetwerden.Pourl' étudeetlarechercheuniquement àdes