医学基因工程的工具酶课件

基因工程的工具酶基因工程的工具酶基因工程的工具酶〔instrumentalenzymeofgeneengineering〕是应用于基因工程各种酶的总称，包括核酸序列分析、标记探针制备、载体构建、目的基因制取、重组体DNA制备等所需要的酶类。基因工程的工具酶〔instrumentalenzymeo核酸酶：能够将聚核苷酸链的磷酸二酯键切断的酶，属于水解酶。核酸酶：能够将聚核苷酸链的磷酸二酯键切断的酶，属于水解酶。核酸酶的分类：1〕根据核酸底物分RNA酶〔Rnase〕、DNA酶〔Dnase〕和底物非专一性核酸酶；2〕根据作用方式分内切核酸酶〔endonuclease〕和外切核酸酶〔exonuclease〕；3)根据对底物碱基专一性分碱基专一性核酸酶〔切割部位的碱基序列高度专一性〕和非碱基专一性核酸酶〔切割部位的碱基序列随机性〕核酸酶的分类：〖医学〗基因工程的工具酶课件〖医学〗基因工程的工具酶课件在限制修饰系统中，限制作用是指一定类型的细菌可以通过限制性核酸内切酶的作用，破坏入侵的外源DNA(如噬菌体DNA等)，使得外源DNA对生物细胞的入侵受到限制；而生物细胞(如宿主)自身DNA分子通过甲基化酶的作用，在碱基特定位置上发生了甲基化，可免遭自身限制性内切酶的破坏。

限制－修饰作用实际就是细菌中的限制性内切酶降解外源DNA，维护自身遗传稳定的保护机制。

在限制修饰系统中，限制作用是指一定类型

用于核酸操作的工具酶限制性核酸内切酶DNA聚合酶DNA连接酶核酸修饰酶核酸酶用于核酸操作的工具酶限制性核酸内切酶DNA聚合酶DNA限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶的发现及其生物功能识别双链DNA分子中的特定序列，并切割DNA双链主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵细菌的限制与修饰作用1968年，Smith等人首先从流感嗜血杆菌d株中别离出HindⅡ和Hind

Ⅲ

限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶的发现及其生物功能识别双链D限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶的类型主要特性I型II型III型限制修饰多功能单功能双功能蛋白结构异源三聚体同源二聚体异源二聚体辅助因子ATPMg2+SAMATPMg2+SAMMg2+识别序列TGAN8TGCT旋转对称序列GAGCCAACN6GTGCCAGCAG切割位点距识别序列1kb处识别序列内或附近距识别序列下游随机性切割特异性切割24-26bp处限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶的类型主要特性限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶的命名属名种名株名Hind

Ⅲ

Hind

ⅡHaemophilusinfluenzae

d

嗜血流感杆菌d株同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶的命名属名限制性核酸内切酶II型限制性核酸内切酶的根本特性识别双链DNA分子中4-8对碱基的特定序列大局部酶的切割位点在识别序列内部或两侧识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构5‘…GCTGAATTCGAG…3’3‘…CGACTTAAGCTC…5’EcoRⅠ的识别序列EcoRⅠ的切割位点限制性核酸内切酶II型限制性核酸内切酶的根本特性识别双链D回文结构〔palindrome〕：序列正读和反读是一样的，即有一个中心对称轴，从这个轴朝两个方向读序列是完全一样的。在切割位点处，限制性核酸内切酶的作用下磷酸二酯键会发生水解效应，从而导致链的断裂。回文结构〔palindrome〕：序列正读和反读是一样的，即限制性核酸内切酶的切割类型：〔1〕两条链上的断裂位置是交错和对称围绕着一个对称轴排列，这种形式的断裂结果形成具有粘末端的DNA片段；〔2〕两条链上的断裂位置是处在一个对称轴的中心，这样形式的断裂是形成具有平末端的DNA片段。限制性核酸内切酶的切割类型：EcoRⅠ等产生的5’粘性末端5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’EcoRⅠ37℃5‘…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C…5’退火4-7℃5‘…G-C-T-GA-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-AG-C-T-C…5’OHPOHPEcoRⅠ等产生的5’粘性末端5‘…G-C-T-G-A-PstⅠ等产生的3’粘性末端5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’PstⅠ37℃5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-OH

P-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-P

OH-A-C-G-T-C-C-T-C…5’退火4-7℃5‘…G-C-T-C-T-G-C-AG-G-A-G…3’3‘…C-G-A-GA-C-G-T-C-C-T-C…5’OHPOHPPstⅠ等产生的3’粘性末端5‘…G-C-T-C-T-GPvuⅡ等产生的平头末端5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C…5’PvuⅡ37℃5‘…G-C-T-C-A-G-OH

P-C-T-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-T-C-P

OH-G-A-C-C-T-C…5’PvuⅡ等产生的平头末端5‘…G-C-T-C-A-G-C3.病毒性肺炎如冠状病毒、腺病毒、流感病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒等。4.真菌性肺炎如白念珠菌、曲霉、放射菌等。5.其它病原体所致的肺炎如立克次体、弓形虫、原虫、寄生虫如肺包虫、肺吸虫、肺血吸虫〕等。机体免疫力低下者〔如艾滋病患者〕容易伴发肺部卡氏肺包子虫、军团菌、鸟形分支杆菌、结核菌、弓形体等感染。6.理化因素所致的肺炎如放射性肺炎、胃酸吸入、药物等引起的化学性肺炎等。7.支原体肺炎由肺炎支气体引起。编辑本段发病原因

肺炎患肺炎的原因可能是：接触到一些厉害的病菌或病毒身体抵抗力弱，如长期吸烟。上呼吸道感染时，没有正确处理。例如是没有正确地看医生、没有正确地看服药，又或者是滥用止咳药止咳以至痰和菌愈积愈多〔Sputumretention)。如果一年内有多过一次真正的肺炎〔一些医生误看X光片或滥用了肺炎的诊断)，原因可能是：身体抵抗力弱〔先天性或后天性)气管有异物。尤其是幼童。心肺有其它病变：如癌病、气管扩张、肺尘埃沉着病、没有正确地看医生、没有正确地看服药，又或者是滥用止咳药止咳以至痰和菌愈积愈多〔Sputumretention)工作环境有问题。注意改善空气流通、冷气系统。打造最权威的专业课件医学精品课件本文档免费浏览阅读，下载后可以编辑修改。3.病毒性肺炎如冠状病毒、腺病毒、流感病毒、巨细胞病毒、单位点偏爱〔sitepreference〕某些限制性内切酶对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率。位点偏爱〔sitepreference〕星号活性〔staractivity〕又称星活性，一些限制性内切酶在某些反响条件变化时酶的专一性发生改变，如酶浓度过高、反响液离子强度过低、pH改变、有机溶剂的影响等条件，酶切割位点专一性发生改变。星号活性〔staractivity〕同裂酶(isoschizomers)

有些来源不同的限制性核酸内切酶识别同样的核苷酸靶序列，产生同样的切割，形成同样的末端。例如，XmaI〔CCCGGG〕SmaI〔CCCGGG〕

同裂酶(isoschizomers)

有些

同尾酶

(isocaudamers)来源不同，识别的靶序列也各不相同，但都能产生相同的粘性末端，称为同尾酶。常用的BamHⅠ，BclⅠ，BglⅡ，XhoⅠ就是一组同尾酶，它们切割DNA之后都形成由-GATC-4个核苷酸组成的粘性末端。

同尾酶

(isocaudamers)限制性核酸内切酶II型限制性核酸内切酶酶解反响的操作大局部II型核酸内切酶需要相似的反响条件：Tris-HCl50mMMgCl210mMNaCl0-150mMDTT1mM0-50mM低盐酶100mM中盐酶150mM高盐酶Volume20-100mlTT37℃1-2hr1U核酸内切酶的酶活性：在最正确反响条件下反响1小时，完全水解1mg标准DNA所需的酶量限制性核酸内切酶II型限制性核酸内切酶酶解反响的操作大局部限制性核酸内切酶II型限制性核酸内切酶酶解反响的操作II型核酸内切酶的多酶联合酶解：对盐浓度要求相同的酶，原那么上可以同时酶切，但应注意：5‘…GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’3‘…CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’BamHⅠ

SmaⅠ5‘…GCTACATG

GATCCCGGGTTCGCAT…3’3‘…CGATGTACCTAG

GGCCCAAGCGTA…5’5‘…GCTACATGGATCCC

GGGTTCGCAT…3’3‘…CGATGTACCTAGGG

CCCAAGCGTA…5’限制性核酸内切酶II型限制性核酸内切酶酶解反响的操作II限制性核酸内切酶II型限制性核酸内切酶酶解反响的操作II型核酸内切酶的多酶联合酶解：对盐浓度要求不同的酶，可采取以下方法：使用较贵酶的盐浓度，加大廉价酶的用量，同时酶解低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切倍体积的3MNaAc倍体积的冰冷乙醇-20℃冰浴30分钟、高速冷冻离心10分钟、枯燥限制性核酸内切酶II型限制性核酸内切酶酶解反响的操作II限制性核酸内切酶影响限制性核酸内切酶活性的因素DNA样品的纯度：蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等加大酶的用量，1mgDNA用10U酶加大反响总体积延长反响时间限制性核酸内切酶影响限制性核酸内切酶活性的因素DNA样品的纯限制性核酸内切酶影响限制性核酸内切酶活性的因素DNA样品的甲基化程度：识别序列中特定核苷酸的甲基化会强烈抑制限制酶的活性因此在基因克隆中使用的是失去甲基化酶的大肠杆菌株限制性核酸内切酶影响限制性核酸内切酶活性的因素DNA样品的甲影响限制性核酸内切酶活性的因素

DNA的分子结构某些限制性核酸内切酶切割超螺旋的质粒DNA或病毒DNA所需要的酶量，要比消化线性DNA的高出许多倍。此外，还有一些核酸内切限制酶，切割它们自身处于不同部位的限制位点，其效率亦有明显的差异。影响限制性核酸内切酶活性的因素

DNA的分子结构限制性核酸内切酶影响限制性核酸内切酶活性的因素核酸内切酶的缓冲液性质：高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的Staractivity现象

EcoRⅠ在正常条件下识别并切割5‘GAATTC3’序列，但在甘油浓度超过5%〔v/v〕时，也可切割5‘AATT3’序列限制性核酸内切酶影响限制性核酸内切酶活性的因素核酸内切酶的缓酶活性的正常发挥，是绝对需要二价阳离子，通常是Mg2+。缓冲液Tris—HCl的作用在于使反响混合物的pH恒定在酶活性所要求的最正确数值范围之内。对绝大多数限制酶来说，在的条件下，其功能最正确。巯基试剂对于保持某些内切酶的稳定性是有用的，但它同样也可能有利于潜在污染杂质的稳定性。酶活性的正常发挥，是绝对需要二价阳离子，通常是Mg2+。影响限制性核酸内切酶活性的因素酶切消化反响的温度大多数核酸内切限制酶的标准反响温度都是37℃，但也有许多例外的情况。影响限制性核酸内切酶活性的因素限制性内切酶反响的终止消化DNA样品后，在进一步处理DNA样品前往往需要钝化内切酶的活性，钝化大多数限制性内切酶的方法是65℃温浴5分钟。但有些酶，如BamHI和HaeⅡ具备对热稳定性，那么需参加终止反响液〔参加0.5mol／L的EDTA使之在溶液中的终浓度到达10mmol/L以螯合Mg2+〕。限制性内切酶反响的终止限制性核酸内切酶的特点识别位点的DNA序列具有回文结构；切割DNA均产生含5’磷酸和3’羟基的末端；错位切割产生粘端，沿对称轴切割产生平末端；限制性核酸内切酶的特点识别位点的DNA序列具有回文结构；限制性核酸内切酶的应用在特异位点上切割DNA，产生特异的限制酶切片断；用限制酶切割产生的相同粘末端以便重组；建立DNA的限制酶切图谱；构建基因组文库。限制性核酸内切酶的应用在特异位点上切割DNA，产生特异的限制利用限制酶对DNA进行消化的具体步骤：不同的限制酶生产厂家往往推荐使用截然不同的反响条件，甚至对同一种酶也如此，所以建议遵循与酶一起提供的说明书进行操作。以下是对0.2—1.0ugDNA进行消化的典型反响步骤，如要对更大量的DNA进行消化，那么反响的各个成分须相应放大。利用限制酶对DNA进行消化的具体步骤：1)参加适宜体积的DNA溶液；2)参加2ul适当的10X限制酶消化缓冲液，轻敲管外壁以混匀之；3)参加1－2单位限制酶，轻弹管外壁以混匀之；4)将上述混合的反响物置于适当温度并按所需的时间进行温育；M/LEDTA〔〕使终浓度达10mM／L，以终止反响；6)如果消化后DNA直接进行凝胶电泳分析，可参加6ul凝胶电泳加样缓冲液混合后，再加样进行电泳。

如欲纯化酶切后的DNA，可用酚和氯仿抽提后，乙醇沉淀DNA。1)参加适宜体积的DNA溶液；使用限制酶的注意点：1〕限制酶十分昂贵!为能从贮存管内取出极少量的酶，只要用移液器吸头在酶溶液外表轻沾一下即可，这样可以取到少至0.1ul的酶。浓缩的限制酶也可在使用前用限制酶缓冲液稀释，但切勿用水稀释以免酶变性。2)限制酶在50％甘油中保存于-20℃时是稳定的。进行酶切消化时，将除酶以外的所有反响成分参加后加以混匀，再从冰箱内取出贮酶管，立即放置于冰上。每次取酶时都应换一个无菌吸头，一旦限制酶中污染了DNA或其它酶，将造成财力和时间上的浪费。操作要尽可能快，用完后立即将酶放回冰箱，以使酶在冰箱外放置的时间尽可能缩短。3)尽量减少反响中的加水量以使反响体积减到最小，但要确保酶体积不超过反响总体积的1／10，否那么，限制酶活性将受到甘油的抑制。4)通常延长消化时间可使所需的酶量减少，这在切割大量DNA时不失为一大节约方法。在消化过程中，可取少量反响液进行电泳以判断消化程度。使用限制酶的注意点：DNA聚合酶作用的特点：〔1〕要有底物4种dNTP为前体催化合成DNA；〔2〕接受模板指导；〔3〕需要有引物〔3’羟基〕的存在；〔4〕不能起始合成新的DNA链；〔5〕催化dNTP加到生长中的DNA链3’-OH末端；〔6〕催化DNA的合成方向是5’—3’。DNA聚合酶DNA聚合酶作用的特点：DNA聚合酶〖医学〗基因工程的工具酶课件DNA聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶I〔DNApolI〕5’→3’的DNA聚合酶活性5’→3’的核酸外切酶活性3’→5’的核酸外切酶活性大肠杆菌DNA聚合酶I的根本性质：3‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A…5’5‘…C-G-A-G-T-OH5‘pppdNMg2+3‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A…5’5‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-OHDNApolIDNA聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶I〔DNApolIDNA聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶I〔DNApolI〕缺口平移：5’→3’的核酸外切酶和聚合酶活性协同作用，使缺口向前推进大肠杆菌DNA聚合酶I的根本用途：Nicktranslation制备DNA探针DNA聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶I〔DNApolI〖医学〗基因工程的工具酶课件DNA聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶I大片段〔Klenow〕Klenow酶的根本性质：大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ经枯草杆菌蛋白酶处理，获得N端三分之二的大肽段，即为Klenow酶Klenow酶仍拥有5’→3’的DNA聚合酶活性和3’→5’的核核酸外切酶活性，但失去了5’→3’的核酸外切酶活性DNA聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶I大片段〔KlenowDNA聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶I大片段〔Klenow〕Klenow酶的根本用途：补平由核酸内切酶产生的5’粘性末端DNA片段的同位素末端标记cDNA第二链的合成双脱氧末端终止法测定DNA序列DNA聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶I大片段〔KlenowDNA聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶I大片段〔Klenow〕Klenow酶的根本用途：补平由核酸内切酶产生的5’粘性末端5‘…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C…5’KlenowdATPdTTP5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-T-T-A-A-G-C-T-C…5’DNA聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶I大片段〔KlenowDNA聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶I大片段〔Klenow〕Klenow酶的根本用途：DNA片段的同位素末端标记5‘…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C…5’Klenowa-32P-pppdATPdTTP5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-T-T-A-A-G-C-T-C…5’DNA聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶I大片段〔KlenowDNA聚合酶T4-DNA聚合酶T4-DNA聚合酶的根本特性：在无dNTP时，可以从任何3’-OH端外切在只有一种dNTP时，外切至互补核苷酸暴露时停止在四种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位5’→3’的DNA聚合酶活性和3’→5’的核酸外切酶活性DNA聚合酶T4-DNA聚合酶T4-DNA聚合酶的根本特性：DNA聚合酶T4-DNA聚合酶T4-DNA聚合酶的根本用途：切平由核酸内切酶产生的3’粘性末端5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-OH

P-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-P

HO-A-C-G-T-C-C-T-C…5’T4-DNA聚合酶5‘…G-C-T-C-OH

P-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-P

HO-C-C-T-C…5’注意：该酶也能降解双链DNA，只是其活性比单链降解活性低很多DNA聚合酶T4-DNA聚合酶T4-DNA聚合酶的根本用途：DNA聚合酶T4-DNA聚合酶T4-DNA聚合酶的根本用途：DNA片段的同位素末端标记5‘G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T3’3‘C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A5‘Mg2+5‘pppdNTPa-32P-dATP5‘G-C-T-CA-G-C-T-G-OH

HO-T-C-G-A-C-C-T-C-A5‘T4-DNApolT4-DNApol5‘G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T3’3‘C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A5‘DNA聚合酶T4-DNA聚合酶T4-DNA聚合酶的根本用途：DNA聚合酶T7噬菌体DNA聚合酶T7噬菌体DNA聚合酶的根本特性：DNA聚合酶中持续合成能力最强改造后成为双脱氧终止法对长片段DNA的测序酶5’→3’的DNA聚合酶活性和3’→5’的核酸外切酶活性DNA聚合酶T7噬菌体DNA聚合酶T7噬菌体DNA聚合酶的根DNA聚合酶T7噬菌体DNA聚合酶T7噬菌体DNA聚合酶的根本用途：用于拷贝长段模板的引物延伸反响通过补平或交换〔置换〕反响进行快速末端标记DNA聚合酶T7噬菌体DNA聚合酶T7噬菌体DNA聚合酶的根末端脱氧核苷酸转移酶〔TdT〕TdT的根本特性：来自小牛胸腺不需要模板的DNA聚合酶，随机掺入dNTPs5‘p3‘HOOH3‘p5‘TdTCo2+

dATP5‘p3‘HOAAAAAAAAAAAAOH3‘p5‘DNA聚合酶末端脱氧核苷酸转移酶〔TdT〕TdT的根本特性：来自小牛胸腺TdT的根本特性：5‘p3‘HOOH3‘

p5‘

TdTCo2+

dATP5‘p3‘HOAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAOH3‘

p5‘

5‘p3‘HOOH3‘

p5‘

TdTCo2+

dATP5‘p3‘HOAAAAAAAAAAAAAAOH3‘

p5‘

AAAAAAAAAAAAATdT的根本特性：5‘p3‘HOOH3‘p5‘DNA聚合酶TdT的根本用途：DNA片段3’末端的同位素标记给载体或目的DNA加上互补的同聚物尾DNA聚合酶TdT的根本用途：DNA片段3’末端的同位素标记DNA聚合酶依赖于RNA的DNA聚合酶〔反转录酶〕反转录酶的根本特性：以RNA为模板聚合cDNA链3’AAAAAAAAAAAAAA5’mRNA反转录酶Mg2+dNTP5’TTTTTTTTTTTToligo(dT)12-183’AAAAAAAAAAAAAA5’mRNA5’TTTTTTTTTTTTTT3’cDNADNA聚合酶依赖于RNA的DNA聚合酶〔反转录酶〕反转录酶的DNA聚合酶依赖于RNA的DNA聚合酶〔反转录酶〕反转录酶的根本特性：双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链反转录酶3’RNA5’

DNA3’5’3’RNA5’

DNA3’5’反转录酶5’

DNA3’DNA聚合酶依赖于RNA的DNA聚合酶〔反转录酶〕反转录酶的DNA聚合酶依赖于RNA的DNA聚合酶〔反转录酶〕基因工程中常用的反转录酶：一种提取自纯化的禽成髓细胞瘤病毒〔AMV〕禽源反转录酶在42℃发挥作用，而鼠源反转录酶在42℃失活一种是Moloney鼠白血病病毒〔MMLV〕克隆的反转录酶基因在大肠杆菌的表达产物DNA聚合酶依赖于RNA的DNA聚合酶〔反转录酶〕基因工程中DNA聚合酶依赖于RNA的DNA聚合酶〔反转录酶〕反转录酶的根本用途：将真核基因的mRNA转录成cDNA，构建cDNA文库代替Klenow片段，用于DNA序列测定对具有5‘突出端的DNA片段的3’端进行补平和标记、制备探针DNA聚合酶依赖于RNA的DNA聚合酶〔反转录酶〕反转录酶的DNA聚合酶耐热DNA聚合酶〔Taq酶〕Taq酶的特点：热稳定性忠实性：5’-3’聚合酶活性和5’-3’外切酶活性离子依赖性DNA聚合酶耐热DNA聚合酶〔Taq酶〕Taq酶的特点：热稳DNA连接酶的发现1967年，世界上有数个实验室几乎同时发现了一种能够催化在2条DNA链之间形成磷酸二酯键的酶，即DNA连接酶〔1igase〕。这种酶需要在一条DNA链的3’末端具有一个游离的羟基(-OH)，和另一条DNA链的5’末端具有一个磷酸基团(-P)，只有在这种情况下，才能发挥其连接DNA分子的功能作用。DNA连接酶DNA连接酶的发现DNA连接酶值得注意的一点是，DNA连接酶并不能连接两条单链DNA分子或环化单链DNA分子，被连接的DNA链必须是双螺旋的一局部。

值得注意的一点是，DNA连接酶并不能连接两用于共价连接DNA片段的连接酶有两种不同的来源：一种是由大肠杆菌染色体编码的DNA连接酶：另一种是由大肠杆菌T4噬菌体DNA编码的T4DNA连接酶。这两种DNA连接酶，除了前者用NAD+[烟酰胺腺嘌呤二核苷酸]作能源辅助因子，后者用ATP[腺苷三磷酸]作能源辅助因子外，其它的作用机理并没有什么差异。

用于共价连接DNA片段的连接酶有两种不〖医学〗基因工程的工具酶课件〖医学〗基因工程的工具酶课件DNA连接酶DNA连接酶的根本性质修复双链DNA上缺口处的磷酸二酯键DNA连接酶5‘…G-C-T-C-T-G-C-AG-G-A-G…3’3‘…C-G-A-GA-C-G-T-C-C-T-C…5’OHPOHP5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’nicknickDNA连接酶DNA连接酶的根本性质修复双链DNA上缺口处的磷DNA连接酶DNA连接酶的根本性质修复与RNA链结合的DNA链上缺口处的磷酸二酯键T4-DNA连接酶5‘…G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G

A-C-G-G-C-C-T-C…5’OHPnick5‘…G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-G-C-C-T-C…5’DNA连接酶DNA连接酶的根本性质修复与RNA链结合的DNADNA连接酶DNA连接酶的根本性质连接多个平头双链DNA分子：5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G

…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C

…5’5‘…G-C-T-C-A-G-OH

P-C-T-G-G-A-G

…3’3‘…C-G-A-G-T-C-P

OH-G-A-C-C-T-C

…5’T4-DNA连接酶DNA连接酶DNA连接酶的根本性质连接多个平头双链DNA分子DNA连接酶DNA连接酶的反响条件Tris-HCl50-100mMMgCl210mMATP0.5-1mMDTT5mMVolume10-20mlTT4-16℃4-16hr1UDNA连接酶的酶活性：在最正确反响条件下16℃反响1小时，完全连接1mgl-DNA所需的酶量DNA连接酶DNA连接酶的反响条件Tris-HCl50-粘性末端的连接DNA连接酶最突出的特点是，它能够催化外源DNA和载体分子之间发生连接作用，形成重组DNA分子。当然，按上述这种方法构建重组体DNA分子最主要的缺点是，由限制酶切产生的具有粘性末端的载体DNA分子，在连接反响中会发生自我环化作用。为了克服这一缺点，现在的载体一般能提供多克隆位点，可采用双酶切进行酶切。

粘性末端的连接DNA连接酶平头双链DNA片段的连接操作从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接那么属于分子间的连接，因此后者反响速度要慢得多。提高平头末端连接效率的方法包括：加大连接酶用量〔10倍大于粘性末端的连接〕加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞时机参加10%PEG8000，促进大分子之间的有效作用参加单价阳离子〔NaCl〕，最终浓度150-200mMDNA连接酶平头双链DNA片段的连接操作从分子动力学的角度讲平末端DNA片段的连接

不具有粘性末端的DNA分子也可以被连接起来。连接这种平末端DNA分子的方法有4种，〔1〕直接用T4DNA连接酶连接；〔2〕先用末端核苷酸转移酶，给平末端DNA分子加上同聚物尾巴之后再用DNA连接酶进行连接；〔3〕用衔接物连接平末端DNA分子；〔4〕DNA接头连接法。平末端DNA片段的连接〔1〕直接用T4DNA连接酶连接

T4DNA连接酶除了能够封闭具有3’-OH和5’-P末端的双链DNA的单链缺口外，在ATP和高浓度酶的条件下，它还能连接具有完全碱基配对的平末端DNA分子，但平末端连接效率不高，基因操作不经常采用。〔1〕直接用T4DNA连接酶连接〔2〕同聚物加尾连接平末端DNA片段运用末端转移酶，能够将核苷酸加到DNA分子单链延伸末端的3’-OH基团上，不需要模板链的存在，一个个加上核苷酸，构成由核苷酸组成的尾巴，长度可达100个核苷酸。连接分子的裂口可以通过大肠杆菌DNA聚合酶I的作用来填补；留下的单链缺口那么可由DNA连接酶封闭。上述这种连接DNA分子的方法叫作同聚物尾巴连接法，简称同聚物加尾法。

〔2〕同聚物加尾连接平末端DNA片段〖医学〗基因工程的工具酶课件(3)用衔接物连接平末端DNA分子

所谓衔接物(linker)，是指用化学方法合成的一段由10—12个核苷酸组成的、具有一个或数个限制酶识别位点的寡核苷酸片段。衔接物的5’末端和待克隆的DNA片段5’末端，用T4多核苷酸激酶处理使之磷酸化，然后再通过T4DNA连接酶的作用使两者连接起来；接着用适当的限制酶消化具有衔接物的DNA分子和克隆载体分子，这样的结果使二者都产生出了彼此互补的粘性末端。(3)用衔接物连接平末端DNA分子核酸修饰酶T4-多聚核苷酸激酶〔T4-PNP〕T4-PNP的根本特性：在DNA、RNA的5‘-OH上加磷酸5‘HO3‘HOOH3‘OH5‘T4-PNPMg2+pppATP〔g-32P-ATP〕5‘p3‘HOOH3‘p5‘用于探针的末端同位素标记：核酸修饰酶T4-多聚核苷酸激酶〔T4-PNP〕T4-PNP的3.病毒性肺炎如冠状病毒、腺病毒、流感病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒等。多种肺炎细菌均可引起大叶性肺炎，但绝大多数为肺炎链球菌，其中以Ⅲ型致病力最强。肺炎链球菌为革兰阳性球菌，有荚膜，其致病力是由于高分子多糖体的荚膜对组织的侵袭作用。少数为肺炎杆菌、金黄*色葡萄球菌、溶血性链球菌、流感嗜血杆菌等。肺炎链球菌为口腔及鼻咽部的正常寄生菌群，假设呼吸道的排菌自净功能及机体的抵抗力正常时，不引发肺炎。当机体受寒、过度疲劳、醉酒、感冒、糖尿病、免疫功能低下等使呼吸道防御功能被削弱，细菌侵入肺泡通过变态反响使肺泡壁毛细血管通透性增强，浆液及纤维素渗出，富含蛋白的渗出物中细菌迅速繁殖，并通过肺泡间孔或呼吸细支气管向邻近肺组织蔓延，涉及一个肺段或整个肺叶。大叶间的蔓延系带菌的渗出液经叶支气管播散所致。编辑本段临床表现多数起病急骤，常有受凉淋雨、劳累、病毒感染等诱因，约1/3患病前有上呼吸道感染。病程7~10天。〔一〕寒战、高热：典型病例以突然寒战起病，继之高热，体温可高达39℃~40℃，呈稽留热型，常伴有头痛、全身肌肉酸痛，食量减少。抗生素使用后热型可不典型，年老体弱者可仅有低热或不发热。〔二〕咳嗽、咳痰：初期为刺激性干咳，继而咳出白色粘液痰或带血丝痰，经1~2天后，可咳出粘液血性痰或铁锈色痰，也可呈脓性痰，进入消散期痰量增多，痰黄而稀薄。〔三〕胸痛：多有剧烈侧胸痛，常呈针刺样，随咳嗽或深呼吸而加剧，可放射至肩或腹部。如为下叶肺炎可刺激隔胸膜引起剧烈腹痛，易被误诊为急腹症。〔四〕呼吸困难：由于肺实变通气缺乏、胸痛以及毒血症而引起呼吸困难、呼吸快而浅。病情严重时影响气体交换，使动脉血氧饱和度下降而出现紫绀。打造最权威的专业课件本文档免费浏览阅读，下载后可以编辑修改。医学精品课件3.病毒性肺炎如冠状病毒、腺病毒、流感病毒、巨细胞病毒、单〖医学〗基因工程的工具酶课件〔4〕DNA接头连接法DNA接头(adapter)连接法于1978年由康乃尔大学吴瑞教授创造的。它是一类由人工合成的一头具有某种限制性内切酶粘末端，另一头为平末端的特殊双链寡核苷酸片段。当它的平末端与平末端的外源DNA片段连接之后，会使后者成为具粘末端的新DNA分子，从而易于连接重组。

〔4〕DNA接头连接法〖医学〗基因工程的工具酶课件核酸修饰酶T4-多聚核苷酸激酶〔T4-PNP〕T4-PNP的根本特性：在DNA、RNA的5‘-OH上加磷酸5‘HO3‘HOOH3‘OH5‘T4-PNPMg2+pppATP〔g-32P-ATP〕5‘p3‘HOOH3‘p5‘用于探针的末端同位素标记：核酸修饰酶T4-多聚核苷酸激酶〔T4-PNP〕T4-PNP的核酸修饰酶碱性磷酸单酯酶来自小牛胸腺的碱性磷酸单酯酶〔CIP〕68°C时失活来自大肠杆菌的碱性磷酸单酯酶〔BAP〕68°C稳定，且耐酚抽提5‘pOH3‘

DNAorRNA5‘pppdN5‘pppNBAP/CIPOH3‘

5‘HO5‘HOdN5‘HON核酸修饰酶碱性磷酸单酯酶来自小牛胸腺的碱性磷酸单酯酶〔CIP核酸修饰酶碱性磷酸单酯酶碱性磷酸单酯酶根本用途：去除载体DNA5’端磷酸化，防止载体自身环化，减低本底，提高重组率去除DNA和RNA的5‘端磷酸基，然后用T4多聚核苷酸激酶作用下进行末端标记核酸修饰酶碱性磷酸单酯酶碱性磷酸单酯酶根本用途：去除载体DN核酸酶单链核酸外切酶：核酸外切酶VII〔ExoVII〕大肠杆菌的核酸外切酶VII不需要Mg2+ExoVII3’5’3’5’3’5’3’5’核酸酶单链核酸外切酶：核酸外切酶VII〔ExoVII〕大肠杆核酸酶双链核酸外切酶：核酸外切酶III〔ExoIII〕ExoVII3’5’3’5’Mg2+3’5’3’5’大肠杆菌的核酸外切酶III特异性地从3’端外切核酸酶双链核酸外切酶：核酸外切酶III〔ExoIII〕Ex核酸酶双链核酸外切酶：l核酸外切酶〔lExo〕lExo3’5’3’5’Mg2+l核酸外切酶特异性地从5’端外切3’5’3’5’核酸酶双链核酸外切酶：l核酸外切酶〔lExo〕lExo3核酸酶单链核酸内切酶：S1核酸酶S1核酸酶的根本特性：来自稻谷曲霉菌〔Aspergillusoryzae〕Zn2+必需最适pH需要NaCl10-300mM降解单链DNA的速度比降解双链DNA快75000倍降解单链DNA的速度比降解单链RNA快7倍核酸酶单链核酸内切酶：S1核酸酶S1核酸酶的根本特性：来自稻核酸酶单链核酸内切酶：S1核酸酶S1核酸酶的根本反响：内切单链DNA或RNA5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-C-T-T-G-A-G-G-A-G-T…3’S1Zn2+5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-CT-T-G-A-G-G-A-G-T…3’5‘…G-C-T-CA-G-C-T-CT-T-G-A-GG-A-G-T…3’5‘dNMPs或5‘NMPs核酸酶单链核酸内切酶：S1核酸酶S1核酸酶的根本反响：内切单核酸酶单链核酸内切酶：S1核酸酶S1核酸酶的根本反响：内切带缺口或裂口的双链DNA或RNA5‘…G-C-T-C-A-GC-T-G-G-A-G-T…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5‘5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3‘…C-G-A-G-T-C

A-C-C-T-C-A…

5‘nickgapS1Zn2+5‘…G-C-T-C-A-G3‘…C-G-A-G-T-CT-G-G-A-G-T…3’A-C-C-T-C-A…5‘核酸酶单链核酸内切酶：S1核酸酶S1核酸酶的根本反响：内切带核酸酶单链核酸内切酶：S1核酸酶S1核酸酶的重要用途：去除DNA片段的单链突端，使之成为平端去除cDNA合成时形成的发夹结构施行S1核酸酶保护实验，分析转录产物修整渐进性删除突变的末端成熟mRNA与基因组DNA杂交后，结合此酶水解，可定位内含子核酸酶单链核酸内切酶：S1核酸酶S1核酸酶的重要用途：去除D核酸酶单链内切双链外切的核酸酶：Bal31核酸酶从双链DNA的两端3‘和5’同时开始水解两条链对两条链的水解速度不一定相等结果是双链从两头缩短，彻底水解为5‘单核苷酸Bal31核酸酶的根本特性：来自艾氏交替单胞菌〔〕核酸酶单链内切双链外切的核酸酶：Bal31核酸酶从双链DNA核酸酶单链内切双链外切的核酸酶：Bal31核酸酶Ca2+5‘dNMPs或5‘NMPsssDNAorRNACa2+Ca2+核酸酶单链内切双链外切的核酸酶：Bal31核酸酶Ca2+5‘核酸酶单链内切双链外切的核酸酶：Bal31核酸酶Bal31核酸酶的根本用途：诱发DNA突变EcoRIABCEcoRIEcoRIBCABal31BCA环化AC核酸酶单链内切双链外切的核酸酶：Bal31核酸酶Bal31核核酸酶单链内切双链外切的核酸酶：Bal31核酸酶用于不同长度的删除突变克隆实验绘制DNA限制性酶切图谱Bal31核酸酶的根本用途：核酸酶单链内切双链外切的核酸酶：Bal31核酸酶用于不同长度1.大叶性〔肺泡性〕肺炎为肺实质炎症，通常累及肺大叶的全部或大部，并不累及支气管。病原表达在肺泡引起炎症，继之导致局部或整个肺段、肺叶发生炎症改变，致病菌多为肺炎链球菌。本病多见于青壮年，临床起病急，主要病症为寒颤高热、咳嗽、胸痛、呼吸困难和咳铁锈色痰。2.小叶性〔支气管〕肺炎指病原体经支气管入侵，引起细支气管、终末细支气管和肺泡的炎症。病原体有肺炎链球菌、葡萄球菌、病毒、肺炎支原体以及军团菌等。常继发于支气管炎、支气管扩张、上呼吸道病毒感染以及长期卧床的危重病人。3.间质性肺炎以肺间质炎症为主，病变累及支气管壁及其周围组织，有肺泡壁增生及间质水肿。可由细菌、支原体、衣原体、病毒或卡氏肺囊虫等引起。病因学分类1.细菌性肺炎如肺炎链球菌〔即肺炎球菌〕、金黄色葡萄球菌、甲型溶血性链球菌、肺炎克雷白杆菌、流感嗜血杆菌、铜绿假单胞菌、埃希大肠杆菌、绿脓杆菌等。2.非典型病原体所致的肺炎如军团菌、支原体和衣原体等。打造最权威的专业课件医学精品课件本文档免费浏览阅读，下载后可以编辑修改。1.大叶性〔肺泡性〕肺炎为肺实质炎症，通常累及肺大叶的全部基因工程的工具酶基因工程的工具酶基因工程的工具酶〔instrumentalenzymeofgeneengineering〕是应用于基因工程各种酶的总称，包括核酸序列分析、标记探针制备、载体构建、目的基因制取、重组体DNA制备等所需要的酶类。基因工程的工具酶〔instrumentalenzymeo核酸酶：能够将聚核苷酸链的磷酸二酯键切断的酶，属于水解酶。核酸酶：能够将聚核苷酸链的磷酸二酯键切断的酶，属于水解酶。核酸酶的分类：1〕根据核酸底物分RNA酶〔Rnase〕、DNA酶〔Dnase〕和底物非专一性核酸酶；2〕根据作用方式分内切核酸酶〔endonuclease〕和外切核酸酶〔exonuclease〕；3)根据对底物碱基专一性分碱基专一性核酸酶〔切割部位的碱基序列高度专一性〕和非碱基专一性核酸酶〔切割部位的碱基序列随机性〕核酸酶的分类：〖医学〗基因工程的工具酶课件〖医学〗基因工程的工具酶课件在限制修饰系统中，限制作用是指一定类型的细菌可以通过限制性核酸内切酶的作用，破坏入侵的外源DNA(如噬菌体DNA等)，使得外源DNA对生物细胞的入侵受到限制；而生物细胞(如宿主)自身DNA分子通过甲基化酶的作用，在碱基特定位置上发生了甲基化，可免遭自身限制性内切酶的破坏。

限制－修饰作用实际就是细菌中的限制性内切酶降解外源DNA，维护自身遗传稳定的保护机制。

在限制修饰系统中，限制作用是指一定类型

用于核酸操作的工具酶限制性核酸内切酶DNA聚合酶DNA连接酶核酸修饰酶核酸酶用于核酸操作的工具酶限制性核酸内切酶DNA聚合酶DNA限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶的发现及其生物功能识别双链DNA分子中的特定序列，并切割DNA双链主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵细菌的限制与修饰作用1968年，Smith等人首先从流感嗜血杆菌d株中别离出HindⅡ和Hind

Ⅲ

限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶的发现及其生物功能识别双链D限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶的类型主要特性I型II型III型限制修饰多功能单功能双功能蛋白结构异源三聚体同源二聚体异源二聚体辅助因子ATPMg2+SAMATPMg2+SAMMg2+识别序列TGAN8TGCT旋转对称序列GAGCCAACN6GTGCCAGCAG切割位点距识别序列1kb处识别序列内或附近距识别序列下游随机性切割特异性切割24-26bp处限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶的类型主要特性限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶的命名属名种名株名Hind

Ⅲ

Hind

ⅡHaemophilusinfluenzae

d

嗜血流感杆菌d株同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶的命名属名限制性核酸内切酶II型限制性核酸内切酶的根本特性识别双链DNA分子中4-8对碱基的特定序列大局部酶的切割位点在识别序列内部或两侧识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构5‘…GCTGAATTCGAG…3’3‘…CGACTTAAGCTC…5’EcoRⅠ的识别序列EcoRⅠ的切割位点限制性核酸内切酶II型限制性核酸内切酶的根本特性识别双链D回文结构〔palindrome〕：序列正读和反读是一样的，即有一个中心对称轴，从这个轴朝两个方向读序列是完全一样的。在切割位点处，限制性核酸内切酶的作用下磷酸二酯键会发生水解效应，从而导致链的断裂。回文结构〔palindrome〕：序列正读和反读是一样的，即限制性核酸内切酶的切割类型：〔1〕两条链上的断裂位置是交错和对称围绕着一个对称轴排列，这种形式的断裂结果形成具有粘末端的DNA片段；〔2〕两条链上的断裂位置是处在一个对称轴的中心，这样形式的断裂是形成具有平末端的DNA片段。限制性核酸内切酶的切割类型：EcoRⅠ等产生的5’粘性末端5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’EcoRⅠ37℃5‘…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C…5’退火4-7℃5‘…G-C-T-GA-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-AG-C-T-C…5’OHPOHPEcoRⅠ等产生的5’粘性末端5‘…G-C-T-G-A-PstⅠ等产生的3’粘性末端5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’PstⅠ37℃5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-OH

P-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-P

OH-A-C-G-T-C-C-T-C…5’退火4-7℃5‘…G-C-T-C-T-G-C-AG-G-A-G…3’3‘…C-G-A-GA-C-G-T-C-C-T-C…5’OHPOHPPstⅠ等产生的3’粘性末端5‘…G-C-T-C-T-GPvuⅡ等产生的平头末端5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C…5’PvuⅡ37℃5‘…G-C-T-C-A-G-OH

P-C-T-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-T-C-P

OH-G-A-C-C-T-C…5’PvuⅡ等产生的平头末端5‘…G-C-T-C-A-G-C3.病毒性肺炎如冠状病毒、腺病毒、流感病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒等。4.真菌性肺炎如白念珠菌、曲霉、放射菌等。5.其它病原体所致的肺炎如立克次体、弓形虫、原虫、寄生虫如肺包虫、肺吸虫、肺血吸虫〕等。机体免疫力低下者〔如艾滋病患者〕容易伴发肺部卡氏肺包子虫、军团菌、鸟形分支杆菌、结核菌、弓形体等感染。6.理化因素所致的肺炎如放射性肺炎、胃酸吸入、药物等引起的化学性肺炎等。7.支原体肺炎由肺炎支气体引起。编辑本段发病原因

肺炎患肺炎的原因可能是：接触到一些厉害的病菌或病毒身体抵抗力弱，如长期吸烟。上呼吸道感染时，没有正确处理。例如是没有正确地看医生、没有正确地看服药，又或者是滥用止咳药止咳以至痰和菌愈积愈多〔Sputumretention)。如果一年内有多过一次真正的肺炎〔一些医生误看X光片或滥用了肺炎的诊断)，原因可能是：身体抵抗力弱〔先天性或后天性)气管有异物。尤其是幼童。心肺有其它病变：如癌病、气管扩张、肺尘埃沉着病、没有正确地看医生、没有正确地看服药，又或者是滥用止咳药止咳以至痰和菌愈积愈多〔Sputumretention)工作环境有问题。注意改善空气流通、冷气系统。打造最权威的专业课件医学精品课件本文档免费浏览阅读，下载后可以编辑修改。3.病毒性肺炎如冠状病毒、腺病毒、流感病毒、巨细胞病毒、单位点偏爱〔sitepreference〕某些限制性内切酶对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率。位点偏爱〔sitepreference〕星号活性〔staractivity〕又称星活性，一些限制性内切酶在某些反响条件变化时酶的专一性发生改变，如酶浓度过高、反响液离子强度过低、pH改变、有机溶剂的影响等条件，酶切割位点专一性发生改变。星号活性〔staractivity〕同裂酶(isoschizomers)

有些来源不同的限制性核酸内切酶识别同样的核苷酸靶序列，产生同样的切割，形成同样的末端。例如，XmaI〔CCCGGG〕SmaI〔CCCGGG〕

同裂酶(isoschizomers)

有些

同尾酶

(isocaudamers)来源不同，识别的靶序列也各不相同，但都能产生相同的粘性末端，称为同尾酶。常用的BamHⅠ，BclⅠ，BglⅡ，XhoⅠ就是一组同尾酶，它们切割DNA之后都形成由-GATC-4个核苷酸组成的粘性末端。

同尾酶

(isocaudamers)限制性核酸内切酶II型限制性核酸内切酶酶解反响的操作大局部II型核酸内切酶需要相似的反响条件：Tris-HCl50mMMgCl210mMNaCl0-150mMDTT1mM0-50mM低盐酶100mM中盐酶150mM高盐酶Volume20-100mlTT37℃1-2hr1U核酸内切酶的酶活性：在最正确反响条件下反响1小时，完全水解1mg标准DNA所需的酶量限制性核酸内切酶II型限制性核酸内切酶酶解反响的操作大局部限制性核酸内切酶II型限制性核酸内切酶酶解反响的操作II型核酸内切酶的多酶联合酶解：对盐浓度要求相同的酶，原那么上可以同时酶切，但应注意：5‘…GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’3‘…CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’BamHⅠ

SmaⅠ5‘…GCTACATG

GATCCCGGGTTCGCAT…3’3‘…CGATGTACCTAG

GGCCCAAGCGTA…5’5‘…GCTACATGGATCCC

GGGTTCGCAT…3’3‘…CGATGTACCTAGGG

CCCAAGCGTA…5’限制性核酸内切酶II型限制性核酸内切酶酶解反响的操作II限制性核酸内切酶II型限制性核酸内切酶酶解反响的操作II型核酸内切酶的多酶联合酶解：对盐浓度要求不同的酶，可采取以下方法：使用较贵酶的盐浓度，加大廉价酶的用量，同时酶解低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切倍体积的3MNaAc倍体积的冰冷乙醇-20℃冰浴30分钟、高速冷冻离心10分钟、枯燥限制性核酸内切酶II型限制性核酸内切酶酶解反响的操作II限制性核酸内切酶影响限制性核酸内切酶活性的因素DNA样品的纯度：蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等加大酶的用量，1mgDNA用10U酶加大反响总体积延长反响时间限制性核酸内切酶影响限制性核酸内切酶活性的因素DNA样品的纯限制性核酸内切酶影响限制性核酸内切酶活性的因素DNA样品的甲基化程度：识别序列中特定核苷酸的甲基化会强烈抑制限制酶的活性因此在基因克隆中使用的是失去甲基化酶的大肠杆菌株限制性核酸内切酶影响限制性核酸内切酶活性的因素DNA样品的甲影响限制性核酸内切酶活性的因素

DNA的分子结构某些限制性核酸内切酶切割超螺旋的质粒DNA或病毒DNA所需要的酶量，要比消化线性DNA的高出许多倍。此外，还有一些核酸内切限制酶，切割它们自身处于不同部位的限制位点，其效率亦有明显的差异。影响限制性核酸内切酶活性的因素

DNA的分子结构限制性核酸内切酶影响限制性核酸内切酶活性的因素核酸内切酶的缓冲液性质：高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的Staractivity现象

EcoRⅠ在正常条件下识别并切割5‘GAATTC3’序列，但在甘油浓度超过5%〔v/v〕时，也可切割5‘AATT3’序列限制性核酸内切酶影响限制性核酸内切酶活性的因素核酸内切酶的缓酶活性的正常发挥，是绝对需要二价阳离子，通常是Mg2+。缓冲液Tris—HCl的作用在于使反响混合物的pH恒定在酶活性所要求的最正确数值范围之内。对绝大多数限制酶来说，在的条件下，其功能最正确。巯基试剂对于保持某些内切酶的稳定性是有用的，但它同样也可能有利于潜在污染杂质的稳定性。酶活性的正常发挥，是绝对需要二价阳离子，通常是Mg2+。影响限制性核酸内切酶活性的因素酶切消化反响的温度大多数核酸内切限制酶的标准反响温度都是37℃，但也有许多例外的情况。影响限制性核酸内切酶活性的因素限制性内切酶反响的终止消化DNA样品后，在进一步处理DNA样品前往往需要钝化内切酶的活性，钝化大多数限制性内切酶的方法是65℃温浴5分钟。但有些酶，如BamHI和HaeⅡ具备对热稳定性，那么需参加终止反响液〔参加0.5mol／L的EDTA使之在溶液中的终浓度到达10mmol/L以螯合Mg2+〕。限制性内切酶反响的终止限制性核酸内切酶的特点识别位点的DNA序列具有回文结构；切割DNA均产生含5’磷酸和3’羟基的末端；错位切割产生粘端，沿对称轴切割产生平末端；限制性核酸内切酶的特点识别位点的DNA序列具有回文结构；限制性核酸内切酶的应用在特异位点上切割DNA，产生特异的限制酶切片断；用限制酶切割产生的相同粘末端以便重组；建立DNA的限制酶切图谱；构建基因组文库。限制性核酸内切酶的应用在特异位点上切割DNA，产生特异的限制利用限制酶对DNA进行消化的具体步骤：不同的限制酶生产厂家往往推荐使用截然不同的反响条件，甚至对同一种酶也如此，所以建议遵循与酶一起提供的说明书进行操作。以下是对0.2—1.0ugDNA进行消化的典型反响步骤，如要对更大量的DNA进行消化，那么反响的各个成分须相应放大。利用限制酶对DNA进行消化的具体步骤：1)参加适宜体积的DNA溶液；2)参加2ul适当的10X限制酶消化缓冲液，轻敲管外壁以混匀之；3)参加1－2单位限制酶，轻弹管外壁以混匀之；4)将上述混合的反响物置于适当温度并按所需的时间进行温育；M/LEDTA〔〕使终浓度达10mM／L，以终止反响；6)如果消化后DNA直接进行凝胶电泳分析，可参加6ul凝胶电泳加样缓冲液混合后，再加样进行电泳。

如欲纯化酶切后的DNA，可用酚和氯仿抽提后，乙醇沉淀DNA。1)参加适宜体积的DNA溶液；使用限制酶的注意点：1〕限制酶十分昂贵!为能从贮存管内取出极少量的酶，只要用移液器吸头在酶溶液外表轻沾一下即可，这样可以取到少至0.1ul的酶。浓缩的限制酶也可在使用前用限制酶缓冲液稀释，但切勿用水稀释以免酶变性。2)限制酶在50％甘油中保存于-20℃时是稳定的。进行酶切消化时，将除酶以外的所有反响成分参加后加以混匀，再从冰箱内取出贮酶管，立即放置于冰上。每次取酶时都应换一个无菌吸头，一旦限制酶中污染了DNA或其它酶，将造成财力和时间上的浪费。操作要尽可能快，用完后立即将酶放回冰箱，以使酶在冰箱外放置的时间尽可能缩短。3)尽量减少反响中的加水量以使反响体积减到最小，但要确保酶体积不超过反响总体积的1／10，否那么，限制酶活性将受到甘油的抑制。4)通常延长消化时间可使所需的酶量减少，这在切割大量DNA时不失为一大节约方法。在消化过程中，可取少量反响液进行电泳以判断消化程度。使用限制酶的注意点：DNA聚合酶作用的特点：〔1〕要有底物4种dNTP为前体催化合成DNA；〔2〕接受模板指导；〔3〕需要有引物〔3’羟基〕的存在；〔4〕不能起始合成新的DNA链；〔5〕催化dNTP加到生长中的DNA链3’-OH末端；〔6〕催化DNA的合成方向是5’—3’。DNA聚合酶DNA聚合酶作用的特点：DNA聚合酶〖医学〗基因工程的工具酶课件DNA聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶I〔DNApolI〕5’→3’的DNA聚合酶活性5’→3’的核酸外切酶活性3’→5’的核酸外切酶活性大肠杆菌DNA聚合酶I的根本性质：3‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A…5’5‘…C-G-A-G-T-OH5‘pppdN