微生物学实验1口腔微生物的染色观察与显微镜油镜的使用;细菌的革兰氏染色

微生物学实验应当掌握1、微生物的观察方法（制片、染色、油镜的使用）2、微生物的培养方法（培养基配制、分装、包扎、灭菌）3、无菌操作技术（火焰灭菌、倒平板、划线、涂平板、接种）第一页，共三十二页。本课程的成绩考核：基础实验：60%由单个实验的成绩相加组成。每次实验由实验指导老师根据出勤、实验操作、实验报告等进行评定，具体比例为：实验出勤及实验态度占20％；实际操作30％；实技能考核30％；实验报告占20％。自主设计实验：40%设计实验方案实验操作总结第二页，共三十二页。实验一

细菌的革兰氏染色

实验目的

实验原理

实验材料

实验方法实验结果

注意事项

实验报告

思考题微生物学实验-1第三页，共三十二页。1.了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。2.学习并掌握革兰氏染色技术，进一步熟练光学显微镜油镜的使用技术。实验目的第四页，共三十二页。革兰氏染色法（Gramstaining）是微生物学中常用的一种染色方法，该染色法由丹麦医生（ChristianGram）于1884年创立，故名。实验原理第五页，共三十二页。G+细菌G-细菌第六页，共三十二页。革兰氏染色机理

G+细菌由于细胞壁较厚、肽聚糖含量较高和其分子交联度较紧密，故在用乙醇洗脱时，肽聚糖网孔会因脱水而明显收缩，因不含脂类，故乙醇处理不能在壁上溶出缝隙，因此，结晶紫与碘复合物仍牢牢阻留在其细胞内，使其呈现紫色。

G-细菌因其壁薄、肽聚糖含量低和交联松散，故遇乙醇后，肽聚糖网孔不易收缩，加上它的类脂含量高，所以当乙醇把类脂溶解后，在细胞壁上就会出现较大的缝隙，结晶紫与碘的复合物极易被溶出细胞壁，因此，通过乙醇脱色后，细胞又呈无色。这时再经番红复染，就使G-细菌染成红色，而G+细菌仍呈紫色。第七页，共三十二页。结晶紫初染全部细胞紫色碘液媒染全部细胞紫色乙醇脱色G-菌无色G+菌紫色

番红复染G-菌红色G+菌紫色革兰氏染色各步骤时细菌的外观第八页，共三十二页。结晶紫初染碘液媒染乙醇脱色番红复染结晶紫碘液乙醇番红第九页，共三十二页。菌种大肠杆菌（Escherichiacoli）金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）试剂：

蒸馏水；草酸铵结晶紫染液；卢戈氏碘液95%乙醇；番红复染液；香柏油；二甲苯光学显微镜实验材料第十页，共三十二页。革兰氏染色操作步骤水洗干燥镜检（油镜）涂片滴水取菌火焰固定结晶紫染色1分钟水洗碘液1分钟乙醇脱色（20~30秒） 水洗番红1分钟水洗实验方法自然干燥第十一页，共三十二页。第十二页，共三十二页。E.coliS.aureus混合菌涂片方法示意图第十三页，共三十二页。第十四页，共三十二页。分辨率D=——数值孔径NA＝n×sin—an=1.515空气n=1λ2NA2a第十五页，共三十二页。电源电源第十六页，共三十二页。显微镜油镜的使用与保护插上电源插头，打开显微镜电源开关。调节显微镜光源。先用低倍镜、高倍镜查找标本视野，下降载物台约2cm，加香柏油一滴于标本的待检部位，换用油镜观察。换用油镜后，眼睛从侧面注视油镜头，缓慢上升载物台至油圈不再扩大为止，此时镜头几乎与装片接触，但不可压及装片。观察标本时，双眼同时挣开，左眼观察，右眼画图。油镜用毕，转动粗调将载物台下降，取下标本，用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头擦净，然后再用擦镜纸擦去二甲苯。7.使各部分还原，物镜镜头呈八字形，光源强度调至最暗，关闭电源，罩上防尘罩，收拾干净台面。第十七页，共三十二页。第十八页，共三十二页。金黄色葡萄球菌(G+)大肠杆菌(G-)实验结果第十九页，共三十二页。大肠杆菌(G-)和金黄色葡萄球菌(G+)第二十页，共三十二页。注意事项1.涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性；自然干燥后再进行火焰固定（以玻片不烫手为宜）。2.染色过程中勿使染色液干涸。3.乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节，脱色不足阴性菌被误染成阳性菌；脱色过度，会使阳性菌被误染成阴性菌。4.选用培养18~24h菌龄的细菌为宜。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使会使革兰氏阳性菌转成阴性反应。第二十一页，共三十二页。实验报告Escherichiacoli

10×100Staphylococcusaureus

10×100混合菌10×100第二十二页，共三十二页。1．通过本实验你认为哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？思考题第二十三页，共三十二页。实验二

口腔微生物的染色观察与显微镜油镜的使用

实验目的

实验原理

实验材料

实验方法实验结果

注意事项

实验报告

思考题微生物学实验-1第二十四页，共三十二页。学习并初步掌握细菌的单染色法。了解口腔内微生物的种类。掌握油镜的使用方法。实验目的第二十五页，共三十二页。细菌的单染色法是微生物学中常用的一种染色方法。人体口腔中特别是在牙垢中，有细菌、真菌、支原体、口腔原虫、病毒等数量众多的微生物，用无菌牙签刮取少许牙垢，涂片染色后用显微镜下即可观察到各类微生物的形态。实验原理第二十六页，共三十二页。试剂：

蒸馏水；石碳酸复红染液；香柏油；二甲苯光学显微镜、灭菌牙签、载玻片实验材料第二十七页，共三十二页。口腔微生物染色操作步骤干燥镜检（油镜）涂片滴水刮取牙垢火焰固定革兰氏染色或复红染色1分钟水洗实验方法自然干燥第二十八页，共三十二页。实验结果第二十九页，共三十二页。第三十页，共三十二页。第三十一页，共三十二页。注意事项1