病理学研究中常用的分子生物学基本技术及其应用课件

病理学研究中常用的分子生物学基本技术及其应用

病理教研室王娅兰分子病理学基本概念

现代分子生物学vs传统病理学疾病发生过程中分子事件及其与疾病发生的关系揭示根本机制复习有关的分子生物学概念(1)核酸的结构与功能核酸---多核苷酸。

核酸由核苷酸组成核苷酸由碱基、核糖/脱氧核糖和磷酸构成碱基有五种：

A腺嘌呤T胸腺嘧啶U尿嘧啶

G鸟嘌呤C胞嘧啶核苷酸连接方式核酸----DNA（脱氧核糖核酸）和RNA（核糖核酸）DNA和RNA的差别从结构上看DNA：含脱氧核糖及胸腺嘧啶ACGTRNA：含核糖及尿嘧啶ACGU从功能上看DNA：构成染色体内的基因组、细胞器基因组，是遗传信息的贮存和

携带者

RNA：包括mRNA(信使RNA),rRNA(核糖体RNA),tRNA(转移RNA)，分别进行转录、转译的功能DNA结构一级结构

即DNA分子中脱氧核苷酸的排列顺序碱基顺序就代表了核苷酸顺序。又称为核苷酸序列或碱基序列二级结构

即DNA分子的双螺旋结构这种双螺旋结构的一个重要特征是：在一定条件下，双链可解开，亦可重新形成双链三级结构

DNA超螺旋结构

DNA复制

双链解链各自为模板合成新的互补链

DNA转录

以DNA为模板合成RNA过程

DNA翻译

蛋白质合成的同义词以遗传密码破读的手段转变为蛋白质的氨基酸排列顺序如GGC——甘氨酸GTC——颉氨酸遗传信息贮存于DNA，在核内通过转录成mRNA，在胞浆内mRNA作直接模板来指导翻译(2)基因(gene)基因表达是指基因的转录翻译以及它们的调控转录在胞核内进行，翻译在胞浆中进行(3)染色质(chromatin)主要成分是DNA和蛋白质，细胞间期,光镜下呈细颗粒状染色体（chromatosome）

主要成分同上，细胞分裂期，由染色质浓集而成，呈杆状,有恒定数目真核生物基因组单复制顺序（singlecopysequence）在整个DNA分子中只出现一次或少数几次中等重复顺序

(moderatelyrepetitivesequences)在DNA分子中重复出现几十到几千次高重复顺序(highlytepetitivesequence)在DNA分子中重复几百万次反转重复顺序(invertedrepetitivesequerce)

其特点是一段碱基呈回文结构

回文结构（palindromicstructure）又称发夹结构(hairpinstructure)如：5’AAGCTAGCTT3’3’TTCGATCGAA5’其中一条单链回折又可形成双链3’TTCGA

∣∣∣∣∣5’AAGCT内含子与外显子内含子（intron）或插入顺序外显子（exon）DNA变性定义变性后性质变性条件DNA复性（renaturation）退火一.病理学研究中常用的分子生物学基本技术(一)核酸分子杂交（nucleicacidmolecularhybridisation）技术

概念具有一定同源性的核酸单链一定条件下碱基互补退火形成双链用带有标记的具有特殊碱基序列（已知碱基序列）的一段DNA或RNA单链片段来检测靶核酸（待测核酸）中是否存在与之同源的序列

已知的核酸序列——即探针（probe）

探针标记1.固相杂交(solid-phasehybridization)概念

固体支持物有硝酸纤维素滤膜、尼龙膜、乳酸颗粒、磁珠和微孔板等基本方法：在此以膜相为例(1)DNA变性：使DNA由双链解链成为单链。是成功的关键(2)变性DNA在硝酸纤维素膜上的固定(3)预杂交(4)杂交(5)洗膜(6)结果显示斑点杂交应用于DNA斑点杂交RNA斑点杂交对于培养细胞，不必提取和纯化RNA，只需简单处理(0.5%NonidetP40低渗缓冲液)

完整细胞斑点杂交NaOH处理，使DNA暴露可用于筛选大量标本，但它不适用于非放射性标记探针(DNA纯度不够)斑点杂交的特点优点

A操作简便、快速，事先不用限制性内切酶消化或凝胶电泳分离核酸样品B可在同一张膜上进行多个样品的检测C可作半定量分析缺点A不能鉴定所测基因的相对分子量B特异性较差，有一定比例的假阳性(3)印迹杂交（blottinghybridization)southern印迹杂交

（southernblottinghybridization）1975年由Southern创建多用限制性内切酶将DNA切成片段进行凝胶电泳分离（分开）,凝胶上使DNA变性原位将单链DNA片段转移固相支持物上再与相应的已标记的探针进行杂交反应用放射性自显影或酶反应显色，确定探针互补的每一条DNA带的位置可用于DNA图谱分析

基因克隆鉴定（克隆基因的酶切图谱分析）

基因构成研究（基因组的定性及定量分析、基因突变分析及限制性长度多态性分析（RFLP）等。），northern印迹杂交（Northernblottinghybridization）其被测样品是RNA方法与southern印迹杂交类似

此法常用于基因表达的研究，可推算出癌基因的表达程度(4)原位杂交（insituhybridization）核酸原位杂交（nucleicacidhybridizationinsitu）的简称已知碱基顺序并带有标记的核酸作为探针与细胞组织切片中待测的核酸特异性结合成杂交体应用与标记物相应的检测系统在被检测的核酸原位检测杂交信号首创放射性标记(1969)荧光素标记(1981)生物素标记(1983)

其与菌落原位杂交不同原位杂交可以确定探针的互补序列在细胞内的空间位置C不需要从组织中提取核酸

D可完整的保持组织与细胞的形态，准确反映其与组织细胞的相互关系原位杂交与免疫组化方法结合免疫组化

检测抗原成分，在翻译水平上研究基因表达

原位杂交检测DNA/RNA，进行基因定位，在基因扩增或在转录水平上研究基因表达原位杂交的探针单链DNA双链DNARNA探针基本方法(RNA杂交为例)

A.杂交前准备

固定尽快予以冷冻/固定

培养细胞、新鲜组织、石蜡包埋组织均可进行原位杂交通常石蜡包埋信号低于冰冻切片C.杂交后处理D.显示

如AP显色系统NBT（四氮唑蓝）显色等有两种方法:

直接法直接标记探针

间接法抗原标记探针,杂交后,再用特异性标记的抗体反应,在呈色双重原位杂交方法

通常有两种方法

A.用相邻的连续切片（3μ），用两种不同的探针进行原位杂交

适用于较大细胞的研究优点

二者杂交过程和结果互不干扰

显示方法和呈色可用同一检测系统，敏感性相同，可比性强缺点

杂交信号可能因切片较薄而减弱寻找同一细胞的切面进行分析有一定困难B.用两种探针在同一标本上作原位杂交，两种不同标记探针的杂交阳性信号呈色不同(5)荧光原位杂交（fluorescenceinsituhybridization,FISH）技术基本原理生物素、地高辛或荧光素标记特异的DNA探针对外周血、肿瘤细胞或癌前组织的离散培养细胞的染色体铺片或切片（包括石蜡切片）DNA-DNA原位杂交荧光素标记抗探针标记物的抗体其杂交定位信号用荧光法显示。可用多种荧光素的不同颜色显示多个染色体的结构或DNA。如FITC

(fluorescienisothiocy-anate,异硫氰酸荧光素)——呈黄绿色

Texas红——呈红色特点

操作简易，快捷,探针标记后稳定方法敏感在同一标本上可以同时检测几个不同的基因不仅可以在染色体分裂相上观察结果，而且可以应用于培养的间期细胞，组织的石蜡切片、冰冻切片应用

临床应用

应用非常广泛研究应用

肿瘤中染色体异常基因图谱绘制确定基因在染色体上的顺序(6)其它杂交方法

A.差异杂交（differentialhybridization）B.cDNA微点阵杂交（cDNAmicroarrayhybridization）C.

寡核苷酸微点阵杂交

（oligonucleotidemicroarrayhybridization）

2.液相杂交

（solutionhybridization）所参加反应的两条核酸链都游离在溶液中(1)吸附杂交方法HAP（羟基磷灰石）吸附杂交方法(DNA:DNA)亲和吸附杂交方法(DNA:RNA)生物素标记DNA探针酰化亲和素包被固相支持物用特异性抗DNA-RNA杂交物的酶标单克隆抗体与固相支持物上的杂交物反应酶显色磁珠吸附杂交方法吖啶翁酯（acridiniumester）标记探针吸附在磁化的有孔小珠(2)发光液相方法能量传递法两个紧接的探针，一个探针的一端用化学发光基团（供体）标记，另一个探针的一端用荧光物质标记，并且这两个探针靠得很近。由于只有在两个探针分子靠得很近时，才能产生发光具有较好的特异性

吖啶翁酯标记法检测杂交探针的化学发光此法敏感度低仅适用于检测扩增的靶序列(3)液相夹心杂交方法亲和杂交方法两个探针与靶核酸杂交，形成夹心结构。杂交物上的吸附探针可结合到固相支持物上杂交物上的检测探针可产生检测信号一般用生物素标记吸附探针，用125I标记检测探针该试验保持了固相杂交的高度特异性(二)聚合酶链反应及其相关技术1.聚合酶链反应（polymerasechainreaction,PCR）技术又称体外基因扩增利用DNA变性和复性原理在体外进行特定的DNA片段高效扩增的技术获得或放大特异基因信号的重要手段基本原理

在模板DNA（待测DNA）引物（模板两端的已知序列）四种脱氧核苷酸(dNTP)DNA聚合酶依赖的酶促合成反应扩增的特异性取决于引物与模板DNA整个步骤分三步变性加热模板DNA成两条单链退火降温模板DNA与引物互补结合延伸DNA聚合酶及镁离子形成与模板链互补的新DNA链三步为一个循环DNA量增加1倍25-30个循环DNA可增加106-109倍

PCR反应体系组分包括引物DNA聚合酶PCR反应缓冲液dNTPs（四种核苷酸）实际操作中,分别有不同的要求和注意事项反应条件应不断优化如变性复性延伸温度及时间循环参数镁离子浓度平台效应防止污染等

PCR模板（待测DNA）细菌全血标本或白细胞新鲜组织石蜡包埋组织

但各自的制备方法各异

PCR扩增产物的检测分析

凝胶电泳分析琼脂糖凝胶电泳(最常用)聚丙烯酰胺凝胶电泳单一条带点杂交方法将产物直接点到膜上2.PCR相关技术(1)定量PCR最常用的为竞争性PCR

(2)逆转录PCR(RT-PCR)

用来扩增RNA的方法

由mRNA逆转录（reversetranscription,RT）反应产生的cDNA第一条链作PCR的模板

(3)竞争逆转录PCR(competitivereversttranscription-polymerasechainreaction,c-RT-PCR)(4)多重PCR(multiplexPCR)

(5)反向PCR(inversePCR)对已知DNA片段两侧未知序列进行扩增(6)不对称PCR

(7)锚定PCR

(8)着色互补试验或荧光PCR(9)双温PCR(two-temperaturePCR)(10)原位PCR（insituPCR,ISPCR）技术90年Hasse首次创建概念在细胞(爬片,甩片,涂片)组织切片(冰冻/石蜡)直接对核酸进行扩增，通过掺入标记基团直接显色或结合原位杂交进行检测的方法

既能在组织原位检测单复制的特定DNA/RNA又能使扩增的特定的DNA/RNA片段在组织切片中定位特点1.PCR特异性高敏感性,又有原位杂交样的定位准确性2.能检测低于2个拷贝量的细胞内特定的DNA序列3.有助于细胞内特定核酸序列定位与其形态学变化的结合分析基本方法

A.细胞或组织切片上滴加PCR反应液B.把载玻片放入热循环仪（原位PCR仪）中进行扩增C.进行原位扩增产物检测

分类A.直接法原位PCR(directinsituPCR)

基本原理对三磷酸核苷酸或引物进行标记使扩增产物直接携带标记分子据标记物性质进行产物的检测

标记物

最常用的有三种

放射性同位素生物素地高辛特点

操作简便特异性较差易出现假阳性扩增效率低应用注意事项

a.不能用于切片标本b.不适用于研究内源性基因重排和染色体易位

B．间接原位PCR(indirectinsitu,PCR)基本原理同常规PCR,不带任何标记物再利用原位杂交方法加以检测

主要步骤

标本固定保持原有组织细胞的形态结构

渗入使引物核苷酸和酶等反应液进入细胞内(如用酶进行消化)

原位扩增通过原位PCR技术（原位PCR仪）增加靶核酸序列的数量，以达到可检测的水平

原位杂交检测用特异性探针检测产物特点

步骤虽然较多，但扩增效率高，特异性较直接法强

在原位PCR中常用的原位杂交标记物

非同位素标记物如生物素地高辛等C．原位反转录PCR

(insitureversetranscription,PCR)又称为insituRT-PCR结合反转录反应（以mRNA为模板合成cDNA）和PCR扩增检测细胞内低复制mRNA的方法

基本原理

它由mRNA经逆转录反应产生cDNA链（即在逆转录酶的催化下，以mRNA为模板合成cDNA）

再以cDNA为模板，用PCR对靶序列进行扩增扩增结束后，再用特异性的探针进行原位杂交

整个反应过程均在固定的组织或细胞标本上进行

标本要用DNA酶处理

原位PCR的应用

1)检测内源性基因

固有基因的检测异常或变异基因

2)外源性基因的检测

感染基因病毒基因细菌基因

导入基因原位PCR应用中存在的问题及对策

敏感性特异性产生假阳性原因(直接法)错配核苷酸错误掺入受损DNA修复;扩增产物弥散对策热启动减少弥散复杂性定量分析目前还停留在相对定量或半定量水平(11)免疫聚合酶链反应（immunopolymerasechainreaction,immuno-PCR,简称免疫PCR）技术由Sano等于1992年首建基本原理单克隆抗体进行生物素化核苷酸（DNA）也生物素化用亲和素或链霉亲和素将两者连接构成具有双功能的嵌合分子单抗--生物素--中介分子--生物素--DNA

(亲和素)与抗原结合PCR扩增抗体端可以与抗原结合，特异性地捕获待测抗原，以保证检测结果的特异性，核酸（DNA）端则可用引物对其进行扩增，通过对扩增产物的检测，间接证明抗原的存在。产物可用琼脂糖电泳检测采用不同大小标准的DNA进行标记，进行电泳检测，则可同时检出不同的抗原分子。(12)原位免疫PCR（insituimmuno-PCR,IS-PCR）技术

基本原理中介分子同时与DNA和抗体分子特异结合其一端连接DNA（DNA作为标记物）另一端连接抗原-抗体复合物形成一个抗原-抗体-DNA连接物作为标记物的DNA分子用原位PCR扩增，检测特异的PCR产物，即可间接地证明抗原的存在

中介分子链酶亲和素（SA）-蛋白A嵌合体(三)用引物介导的原位标记（primedinsitulabelling,PRINS）技术用于细胞或染色体原位检测特异性DNA/RNA基本原理PCR和FISH技术的结合

dUTP（用荧光素如FITC标记）和dATPdCTP,dGTP掺入延伸的DNA中，使新合成的DNA带有荧光素,用荧光显微镜检测地高辛标记再用免疫细胞化学显色普通光学显微镜检测特点及应用前景

1.快速，简便也适用于组织切片2.敏感性和特异性较高.3.具有很高的快速性4.地高辛标记，适用于普通显微镜观察，避免了标本荧光素标记褪色快的缺点5.不需使用DNA或cDNA探针，只需要特异性引物序列，合成简便(四)

基因重组技术基因重组是基因克隆的关键技术。其基本内容包括分离纯化或人工合成DNA制备DNA重组体转化宿主细胞筛选表达重组DNA的宿主细胞使其扩增鉴定目的基因的正确连接及表达主要目的是获得某一基因或DNA片段的大量拷贝目的基因的获得通常所需要的目的基因都是一些已有相关基础研究的基因

常用方法

1.PCR扩增目的基因2.从基因组文库或cDNA文库中获得目的基因3.人工合成目的基因DNA体外重组载体常用的有

质粒载体最常用的是pBR322

噬菌体（phage）载体最常用的为λDNA及其衍生物重组DNA转化宿主细胞重组体克隆的筛选与鉴定酶切、电泳、杂交等方法(五)

基因转染（genetransfection）技术将纯化的含有靶基因的质粒DNA送入细胞内，并在细胞内表达的技术方法有磷酸钙介导的转染法DEAE葡聚糖介导转染法脂质体介导转染法电击基因转染法二.肿瘤研究中常用的分子生物学技术

(一)基因扩增的检测1.原位杂交（ISH）2.荧光原位杂交（FISH）3.Southernblot(DNA杂交)4.Northernblot(RNA杂交)5.原位PCR6.RT_PCR(二)基因突变的检测突变的几种形式点突变基因特定位置发生一个核苷酸的改变基因缺失基因易位或重排其他：插入甲基化染色体非组蛋白改变等突变的检测方法1.聚合酶链反应-单链构象多态性分析（Singlestrandconformationpolymorphismanalysisofpolymerasechainreactionproducts,PCR-SSCP）

长度相同，但碱基序列不同的单链DNA构象不同,在非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，迁移率（泳动率）不同基本方法

作PCR将产物变性而成为单链进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

显示结果

可用同位素/荧光素标记电泳后用相应方法检测(标记在PCR时进行)

非同位素标记电泳后银染显色。特点P