病原性球菌的检验

1、病原性球菌的检验一、葡萄球菌属 Staphylococcus广泛存在于自然界，多数是不致病的腐物寄生菌。 致病性葡萄球菌可引起化脓性炎症、败血症、食物中毒等。分类与分型1）金黄色葡萄球菌(S. aureus)：多数致病。（2）表皮葡萄球菌(S. epidermidis)：偶可致病。（3）腐生葡萄球菌(S. saprophyticus)：不致病。（4）致病性菌株能产生黄色或柠檬色素。（5）多数金黄色葡萄球菌可被相应噬菌体裂解，表皮葡萄球菌不敏感。金黄色葡萄球菌的致病性用噬菌体可将金葡萄菌分为4群23个型。肠毒素型食物中毒由和群金葡萄菌引起，群菌对抗生素产生耐药性的速度比和群缓慢很多。造成医院感染

2、严重流行的是群中的52、52A、80和81型菌株。引起疱疹性和剥脱性皮炎的菌株经常是群71型。 金黄色葡萄球菌的流行病学作为人和动物的常见病原菌，其主要存在于人和动物的鼻腔、咽喉、头发上，50%以上健康人的皮肤上都有金黄色葡萄球菌存在。因而，食品受其污染的机会很多。金黄色葡萄球菌及其检验 革兰氏阳性球状，排列呈葡萄串状。无芽胞、鞭毛，大多数无荚膜，个别形成荚膜。致病性葡萄球菌（金黄色葡萄球菌）菌体较小、约0.51um., 普通0.41.2um。培养及生化特性1.在普通培养基上生长良好（需氧或兼性厌氧，最适生长温度37、pH7.4 ，对营养要求不高，加少量葡萄糖或血液生长更旺盛。 ），在麦康凯琼

3、脂平板不生长。2. 血平板上生长更佳，致病菌株溶血 3. 产生金黄色色素 4. 高度耐盐: 可在7.515%NaCl肉汤中生长。 5. 分解葡、乳、麦、蔗糖， 产酸不产气，触酶阳性，致病菌株能分解甘露醇。6. 金黄色葡萄球菌能产生的毒素和酶 （致病因素P149）1）溶血毒素 2）杀白细胞素3）血浆凝固酶：区分葡萄球菌是否具有致病性的重要标志。 4）脱氧核糖核酸酶： 5）肠毒素 6）溶纤维蛋白酶 7）透明质酸酶抗原性1. 多糖抗原：具有群特异性，存在于细胞壁，借此可分群。A群多糖抗原化学组成为磷壁酸中的N-乙酰葡糖胺核糖醇残基（金黄色葡萄球菌）。B群多糖抗原化学组成是磷壁酸中的N-乙酰葡糖胺甘油

4、残基。2. 蛋白质抗原：细胞壁的一种表面蛋白，人源菌株含SPA（Staphylococcus protein A)，能与多种哺乳动物IgG Fc片段非特异性结合。Ag-Ab(IgG)-SPA 有利于多种微生物抗原检出。3. 荚膜抗原：几乎所有金黄色葡萄球菌菌株的表面均有荚膜多糖抗原的存在。仅个别表皮葡萄球菌有此抗原，抗吞噬作用。磷壁酸：以磷酸多元醇分子的重复结构单位为主链（骨架）的阴离子多聚物。磷壁酸按磷酸多元醇分子的不同分为5种类型，其中以磷酸甘油和磷酸核糖醇两大类最常见。抵抗力抵抗力较强，能在干燥脓汁或血液中存活数月，80 30min可杀死，煮沸迅速死亡，对多种抗生素产生耐药性。临床上用1

5、%-3%的龙胆紫溶液治疗，以防止葡萄球菌引起的化脓症。 致病性和毒力因子1. 致病性：可引起两类疾病侵袭性疾病：主要引起化脓性炎症。通过各种途径侵入机体，导致皮肤或器官的多种感染，甚至败血症。 中毒性疾病：由葡萄球菌产生的外毒素引起。人源多为毒素，动物源则为毒素。2.毒力因子: 包括毒素和酶(1)毒素(Alphatoxin) 损伤细胞膜的毒素，对多种哺乳动物红细胞有溶血作用，对白细胞、血小板、肝细胞、成纤维细胞、血管平滑肌细胞等均有损伤作用(2)肠毒素(enterotoxin) 按抗原性不同，分为A、B、C1、C2、C3、D和E 7个血清型，均可引起急性胃肠炎，即呕吐为主要症状的食物中毒。肠毒

6、素形成条件：存放温度：在37内，温度越高，产毒时间越短；存放地点：通风不良氧分压低易形成肠毒素；食物种类：含蛋白质丰富，水分多，同时含一定量淀粉的食物，肠毒素易生成。(3)凝固酶能使含有抗凝剂的人或兔血浆发生凝集的酶类物质。致病性菌株多数为凝固酶阳性。 游离凝固酶(free coagulase): 使液态纤维蛋白原变成固态纤维蛋白。 结合凝固酶(bound coagulase): 使纤维蛋白原与菌体交联而致细菌凝聚。作用：有助于致病菌株抵抗吞噬细胞和杀菌物质。(4)耐热DNA酶:100，15min不失去活性，由致病性菌株产生。（5）其它致病因子：溶纤维蛋白酶、纤维蛋白溶酶、透明质酸酶，杀白细胞

7、素、磷酸酶、卵磷脂酶和脂酶等，利于细菌扩散。微生物学诊断标本的采集： 化脓性病灶采取脓汁、渗出液； 败血症采取血液；脑膜炎采取脑脊液；食物中毒则分别采集剩余的食物、呕吐物和粪便。直接涂片检查： 注意浓汁、乳汁、液体培养的染色片中常见双球或短链排列的球菌，易误认为是链球菌。分离培养 ： 普通平板培养、血液琼脂平板、高盐培养基。鉴定：纯培养物菌落金黄色，周围呈溶血现象。 1 致病性葡萄球菌的鉴定： （1）产生凝固酶和耐热DNA酶（2）产生金黄色色素，有溶血性 （3）发酵甘露醇 2 葡萄球菌肠毒素的检查： 细菌分离鉴定的同时，接种至肉汤培养基，培养后取滤液注射至6-8周龄的幼猫。ELISA法检测微量

8、肠毒素，PCR或DNA杂交检测产毒素菌株金黄色葡萄球菌的检验方法：增菌培养法、直接计算法1、增菌培养法的检验步骤（程序） 检样稀释7.5%NaCl 肉汤增菌培养 血平板、B-P分离镜检、 血浆凝固酶试验报告结果 2、检验操作要点 1）增菌：7.5%NaCl肉汤，3724h，呈均匀浑浊生长。2）平板分离：血平板,37 2448h菌落成金黄色，大而突起，圆形，不透明，表面光滑，周围有透明溶血圈（型） B-P平板： 主要成分及作用：氯化锂、甘氨酸：抑制非致病性葡萄球菌的生长；丙酮酸钠:：促进葡萄球菌生长亚碲酸钾： 抑制G-杆菌生长，可被金黄色葡萄球菌还原为碲盐呈黑色卵黄:：含蛋白质、卵磷、脂肪。在B

9、-P平板上的菌落特征: 为圆形，光滑凸起、湿润、2-3mm，呈灰色至黑色，边缘色淡周围为浑浊带，在其外层有一透明带。 3）镜检与血浆凝固酶试验从B-P平板上挑取金黄色葡萄球菌的菌落进行镜检如发现葡萄球菌,再做血浆凝固酶试验做血浆凝固酶试验4）结果报告方式：（1）初步报告：根据血平板培养计数和镜检，如发现有G+葡萄串状球菌存在，且有溶血性，则初步报告为：“有金黄色葡萄球菌存在，1g样品约含多少。” （2）结果报告：根据培养特性、镜检、生化试验、动物试验结果，可报告为：“是否是致病性葡萄球菌” .二、链球菌属 Streptococcus链球菌(Streptococcus)是化脓性球菌的另一类常见的

10、细菌，广泛存在于自然界和人及动物粪便和健康人鼻咽部，引起各种化脓性炎症、猩红热、丹毒、败血症、脑膜炎、产褥热以及链球菌变态反应性疾病等。 （一）生物学性状 1、形态与染色 革兰氏阳性；球形或卵圆形，直径0.61.0m。链状排列，短者4-8个细菌，长者有2030个细菌。菌链的长短与菌种及生长环境有关: （1）致病菌株较长，非致病菌株较短； （2）固体培养基多为短链，液体培养基常为长链； （3）病料多呈长链，但败血症猪体分离的多为成双或短链。A、B、C、D群中，多数菌株在血液或血清培养基上的幼龄培养菌或病料中的菌体常见荚膜。除D群一些菌株外，无芽胞, 无鞭毛。2、培养特性 需氧或兼性厌氧，有些为厌

11、氧菌。营养要求较高。普通培养基中需加有血液、血清、葡萄糖等才能生长。最适温度37，最适pH7.4-7.6，血琼脂平板上形成细小露滴状、灰白色、圆而微凸、表面光滑、边缘整齐的菌落； 不同菌株有不同溶血现象：马腺疫链球菌明显溶血、化脓链球菌和兽疫链球菌强溶血、无乳链球菌弱或溶血、乳房炎链球菌或溶血、停乳链球菌和肺炎链球菌溶血。 血清肉汤培养后，有粘稠或絮状沉淀，上液清朗。3、生化反应发酵简单的糖类，产酸不产气。对乳糖、甘露醇、水杨苷等的分解因菌株而异。一般不分解菊糖，不被胆盐或1%去氧胆酸钠所溶解。这两种特性可用来鉴别甲型溶血性链球菌和肺炎球菌。能使牛奶产酸而不凝固，不液化明胶。乙型（ -）溶血链

12、球菌对杆菌肽敏感。4、抗原结构 主要有三种：（1）核蛋白抗原：或称P抗原，无特异性，各种链球菌均同，与葡萄球菌有交叉。 （2）多糖抗原：或称C抗原、系统族特异性抗原，是细菌壁的组成成份。（3）蛋白质抗原：或称表面抗原，包括抗M、R、T、S等四种不同性质的抗原组份，具有型特异性。是链球菌细胞壁的蛋白质抗原，位于C抗原外层，同族链球菌可根据表面抗原不同进行分型，如A族链球菌可据此分为60多型。 兰氏分群法：兰氏（Lancefield)用温热的稀盐酸浸出C抗原，与特异性血清作沉淀反应，将链球菌分为20个血清群（A-V，缺I和J）。同群链球菌间，因表面蛋白质抗原不同，又分不同型。5、致病性链球菌可产生

13、的毒素和酶（致病因素）1）溶血素 2）致热外毒素 3）透明质酸酶4）链激酶 5）链道酶 6）杀白细胞素（二）分类1、根据抗原结构分 根据链球菌细胞壁中多糖抗原的不同，将链球菌分成A、B、C、D、E、F、G、H、K、L、M、N、O、P、Q、R、S、T、U、V （即A-H，K-V）等20个血清群，该分类方法称为Lancefield分类法。 2、根据溶血现象分类 甲（）型溶血性链球菌 菌落周围有不透明溶血环。多为条件性致病菌。 乙（）型溶血性链球菌 菌落周围形成完全透明的无色的溶血环，致病力强。 丙（）型链球菌不产生溶血素，菌落周围无溶血环，也称为不溶血性链球菌。无致病性，常存在于乳类和粪便中，偶尔

14、引起感染。 （三）抵抗力60、30min可杀死大部分链球菌，对一般消毒剂敏感，在干燥尘埃中可存活数日，对青霉素、红霉素、氯霉素、四环素等均敏感，耐药性低。 （四）致病性与毒力因子致病因子：可产生多种酶和外毒素。 （1）M蛋白：是链球菌细胞壁中的蛋白质，具有抗吞噬作用。纯化的M蛋白能使纤维蛋白原沉淀，凝集血小板，白细胞，溶解多形核细胞，并抑制毛细血管中细胞的移动。M蛋白有抗原性，可刺激机体产生型特异性抗体，并与过敏反应有关。 （2）脂磷壁酸（LTA）：与细菌粘附于宿主细胞表面有关，多数LAT位于细胞膜和肽聚糖之间，通过肽聚糖孔伸展至细菌细胞表面，人类口腔粘膜和皮肤上皮细胞、血细胞等细胞膜上均有L

15、AT的结合位点。 （3）透明质酸酶（Hyaluronidaes）：能分解细胞间质的透明质酸，使病菌易于在组织中扩散。又称为扩散因子。 （4）链激酶(Streptokinase，SK)：又称链球菌溶纤维蛋白酶(Streptococcal fibrinolysin)，是一种激酶，能激活血液中的血浆蛋白酶原，成为血浆蛋白酶，可溶解血块或阻止血浆凝固，有利于细菌在组织中的扩散。耐热，100 50min加热仍保持活性。链激酶抗体能中和该酶的活性。 （5）链道酶（Streptodonase）：又名脱氧核糖核酸酶(Streptococcal deoxyribonuclease)。主要由A、C、G群链球菌产生

16、。此酶能分解粘稠脓液中具有高度粘性的DNA，使脓汁稀薄易于扩散。产生的相应抗体有中和该酶的活性。用链道酶制剂进行皮肤试验可作为测定机体细胞免疫的一种方法。 （6）链球菌溶血素（Streptolysin）：溶解红细胞，杀死白细胞及毒害心脏，主要有“O”和“S”两种。 链球菌溶血素O（Streptolysin O，SLO）：为含-SH基的蛋白质，对氧敏感，遇氧时一SH基即被氧化为-SS-基，暂时失去溶血能力。溶血素O能破坏白细胞和血小板。对动物心脏有急性毒害作用。 溶血素“S”（Streptolysin S，SLS）：是一种小分子的糖肽，无抗原性。对氧稳定，对热和酸敏感。血平板所见透明溶血由“S”

17、引起，能破坏白细胞和血小板，给动物静注可迅速致死。注射小鼠腹腔，引起肾小管坏死。 (7)致热外毒素（Pyrogenic extoxin）：曾称红疹毒素(Erythrotoxin)或猩红热毒素(Scarletfever toxin)是人类猩红热的主要致病物质，为外毒素，使病人产生红疹。 该毒素是蛋白质，对热稳定，具有抗原性，产生的抗毒素能中和该毒素的活性。可分为A、B、C三种不同抗原性的毒素，无交叉保护作用。(五) 流行病学（1）化脓性炎症：由皮肤伤口侵入，引起皮肤及皮下组织化脓性炎，如疖痈、蜂窝组织炎、丹毒、乳房炎等。沿淋巴管扩张，引起淋巴管炎，淋巴腺炎，败血症等，经呼吸道侵入，常有急性扁桃腺

18、炎、咽峡炎，并蔓延周围引起脓肿、中耳炎、乳突炎、气管炎、肺炎等。（2）败血症：猪链球菌病的病原至少有三种：马链球菌兽疫亚种、猪链球菌2型、猪链球菌1型。（3）猩红热：由产生致热外毒素的A族链球菌所致的急性呼吸道传染病，临床特征为发热、咽峡炎、全身弥漫性皮疹和疹退后的明显脱屑。（4）变态反应 风湿热：由A族链球菌的多种型别引起，临床表现以关节炎、以肌炎为主。 急性肾小球肾炎：见于人类，大多数由A族12型链球菌引起。临床表现为蛋白尿、浮肿和高血压。 （5）其他疾病 :B族链球菌又称无乳链球菌(Streptococus agalactiae)当机体免疫功能低下时，可引起皮肤感染、心内膜炎、产后感染、新生儿败血症和新生儿脑膜炎。所致疾病小结（六）微生物学诊断标本的采集：采集适当的标本渗出液、脓汁、乳腺炎 乳液、脑脊髓液、尿液和感染组织。 检验方法1、直接检查：可直接涂片，革兰氏染色镜检。2、分离培养：接种血平板，观察菌落形态和溶血情况。3、细菌鉴定：菌落形态、溶血特性、细菌形态、生化特性。如定群、定型，则要作血清学试验。4、血清学试验 （1）可使用特异性血清，对所分离的链球菌进行血清