基因工程-5章 目的基因的制备课件

1、第五章 目的基因的制备一、目的基因的概念二、获得目的基因的方法三、目的基因用途2022/10/171一、目的基因的概念外源基因:插入到载体上并导入到宿主细胞内的特定基因或DNA片段，称为外源基因。目的基因：通常将那些已被或者准备要被分离、改造、扩增或表达的特定基因或DNA片段，称为目的基因。2022/10/172目的基因主要是编码蛋白质(酶)的结构基因，诸如抗逆性相关基因、生物药和保健品相关基因、毒物降解相关基因以及工业用酶相关基因等。随着生物长期的进化，生物界积累了大量对人类有用的基因。它是大自然恩赐于人类的宝贵资源，等待人们去开发利用。2022/10/173二、获得目的基因的方法直接分离法

2、逆转录法聚合酶链式反应法(PCR法)鸟枪法人工化学合成法基因文库法(基因组文库、cDNA文库)mRNA差异显示法2022/10/174鸟枪法 鸟枪法：是将基因组全部打乱,切成碎片,进行随机测序,测序后再将它们拼接起来，进而获得目的基因的方法。鸟枪法适用于原核细菌目的基因的克隆分离。2022/10/175鸟枪法制备目的基因的主要步骤染色体DNA的切断超声波处理：片段长度均一，大小可控，平头末端全酶切： 片段长度不均一，粘性末端便于连接，但有可能使目的基因断开，大小不可控部分酶切： 片段长度可控，含有粘性末端，目的基因完整DNA片段与载体连接如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选

3、择多拷贝克隆载体；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择表达型载体2022/10/177重组DNA分子导入受体细胞如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择大肠杆菌作为受体细胞；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择能使目的基因表达的受体细胞筛选含有目的基因的目的重组子菌落原位杂交法、基因产物功能检测法（筛选模型的建立）2022/10/178对已知定位的目的基因，只要根据目的基因两侧的已知的限制性核酸内切酶识别位点，用适当的限制性核酸内切酶切割，一次就可获得目的基因。即使含目的基因的DNA分子未定序或无定位，也只须先通过酶切分析，随后再通过部分酶切，克隆构建一个非常

4、简单的基因组文库，从中钓出目的基因。 2022/10/1710基因分离的物理化学法这是基因工程在发展初期所用的方法，某些生物的rDNA基因最早都是利用该法分离获得的。基本原理是DNA分子的两条链存在着GC、A=T碱基配对,其中GC间存在3个氢键，AT间存在2个氢键。不同基因片段的碱基组成差异较大，其理化性质，如浮力密度和解链温度等也有明显不同，采用适当方法可从基因组分离出目的基因。物理化学法分离目的基因的方法主要有密度梯度离心法、单链酶解法和分子杂交法等。 2022/10/1711基因的化学合成化学合成DNA的实质是按照序列要求将脱氧核苷酸单体一个个接上去，每接一个单体就是一个循环反应，包括：

5、基团保护、分离、缩合、分离、去保护五大操作单元。2022/10/17122022/10/1715补钉延长法：根据目的基因两条互补链全序列，分别合成12-15碱基长的单链DNA小片段以及20-30碱基长的单链DNA中片段2022/10/1717大片段酶促法：根据目的基因的全序列，分别合成40-50碱基长的单链DNA片段。2022/10/17182022/10/1719DNA化学合成的用途合成天然基因：如生长激素释放抑制素基因、胰岛素基因、干扰素基因等合成探针合成引物合成连接子和接头修饰改造基因：如组织型纤溶酶原激活剂基因、尿激酶原基因等设计新型基因2022/10/1720逆转录法酶促逆转录主要用

6、于合成分子质量较大，转录产物mRNA易分离的目的基因。这种方法以目的基因的mRNA为模板，在逆转录酶的作用下合成互补的DNA，即cDNA，然后在DNA聚合酶的催化下合成双链cDNA片段，与适当的载体重组后转入受体菌扩增，获得目的基因的cDNA克隆。2022/10/1721cDNA第一链的合成2022/10/1722cDNA第二链的合成引导合成法：获得的双链cDNA 能保留完整的5端序列2022/10/1724PCR法扩增目的基因 2022/10/1725应用某种基因大量表达，生产所需要的蛋白质或多肽（如胰岛素、干扰素等药物）。在农、林、牧、副、渔业中，改造某些目的基因，以改良品种，促进经济发展。建立基因疗法，选用某种正常基因，引入患者体内，对某些先天性遗传疾病进行治疗。