参考资料：聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白纯度

1、PAGE3聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白纯度1试剂的配制（1）丙烯酰胺和N,N-甲叉双丙烯酰胺用去离子水配制29%（29 g/100mL，下同）的丙烯酰胺和1%的N,N-甲叉双丙烯酰胺的贮存液。由于丙烯酰胺和双丙烯酰胺在贮存过程中会分别缓慢转变为丙烯酸和双丙烯酸，这一反应是由光或碱催化的。因此在每次使用前，应核实溶液的ol/L、的Tris缓冲液（浓缩胶缓冲液）。（4）TEMEDN,N,N,N-四甲基乙二胺TEMED通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。（5）过硫酸铵用去离子水配制10%的过硫酸铵溶液。过硫酸铵提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基。此溶液须配制新鲜

2、液。（6）Tris甘氨酸电泳缓冲液25mmol/LTris，250mmol/L甘氨酸，%的SDS。（7）样品处理液50mmol/LTrisHCl，100mmol/LDTT巯基苏糖醇或用5%的巯基乙醇，2%的SDS，%的溴酚蓝，10%的甘油。（8）染色液%的考马斯亮蓝R250，40%的甲醇，10%的冰醋酸。（9）脱色液10%的甲醇和10%的冰醋酸。由于制备凝胶的丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性，并且容易被皮肤吸收，因此操作必须在通风橱内或通风处进行。TEMED和过硫酸胺对黏膜和上呼吸道组织、眼睛、皮肤等有很大的破坏作用，吞服可致命。因此在进行电泳操作时一定按照实验要求和步骤，在老师的指导下

3、完成。操作时要戴好一次性手套。2电泳（1）根据厂家说明书安装电泳用的玻璃板。（2）配制SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶溶液。用去离子水，30%的丙烯酰胺，、的Tris缓冲液，10%的，10%的过硫酸胺，混合均匀，迅速灌注在两玻璃板的间隙中间，要留出灌注浓缩胶所需空间梳子的齿长再加0.5 cm，再在胶液面上小心注入一层水（约高23mm），以阻止氧气进入凝胶溶液。（3）分离胶聚合完全后（约30min），倾出覆盖水层，再用滤纸吸净残留水。（4）配制SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶溶液。用去离子水，30%的丙烯酰胺，、的Tris缓冲液，10%的，10%的过硫酸胺，混合均匀，直接灌注在聚合的分离胶上，并立即

4、在浓缩胶溶液中插入干净的梳子。整个操作过程应注意避免气泡的产生。然后再补加浓缩胶溶液，使其充满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室温下聚合。（5）在等待浓缩胶聚合时，可对样品进行处理。在电泳样品中按11体积比加入样品处理液，在100 温度下加热3（6）浓缩胶聚合完全后（30min），小心移出梳子。把凝胶固定于电泳装置上，上下槽各加入Tris甘氨酸电泳缓冲液。必须设法排出凝胶底部两玻璃板之间的气泡。（7）按顺序加样，加样量通常为1025L。样品可以多加几个，例如，血浆样品红细胞破碎后即进行凝胶色谱分离之前的样品和凝胶色谱分离之后的样品。（8）将电泳装置与电源相接，凝胶上所加电压为8V/cm。当染料前沿进入分离胶后，把电压提高到15V/cm，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部上方约1 cm处，关闭电源。（9）从电泳装置上卸下玻璃板，用刮刀撬开玻璃板。将紧靠最左边一孔（第一槽）凝胶下部切去一角，以标注凝胶的方位。（10）将电泳凝胶片放在考马斯亮蓝染色液中染色12h。换脱色液脱色310h，其间需多次更换脱色液至背景清楚。脱色后，可将凝胶浸于水中，长期封装在塑料