基因工程第6章 DNA重组的操作2 (2)课件

1、Review2.1 重组质粒DNA转化大肠杆菌 转化（transformation）定义转化微生物的种类感受态细胞 P139转化过程供体（donor）：提供DNA的生物受体（recipient or host）：获得DNA的生物1.定义转化：受体菌直接吸收供体菌的DNA片断而获得后者部分遗传性状的现象。转化子（transformant）：通过转化方式而形成的杂种后代。2.转化微生物的种类 首次发现转化现象 肺炎链球菌（Griffith,1928） 嗜血杆菌属、芽孢杆菌属、奈瑟氏球菌属、根瘤菌属、葡萄球菌属、假单胞菌属、黄单胞菌属等。3. 感受态（competence）感受态：指受体细胞最易接受

2、外源DNA片断并能实现转化的一种生理状态。感受态是细菌的一种遗传特性，而且也受生长阶段、培养条件的影响。肺炎链球菌 对数生长后期芽孢杆菌属 指数期末和稳定期大肠杆菌 刚进入对数期DH5菌株的OD600 为0.5时,细胞密度在5107 个/ml左右 大肠杆菌的转化方法： Ca 2诱导大肠杆菌转化法 电穿孔转化法 三亲本杂交接合转化大肠杆菌感受态细胞的制备1、挑取平板上的大肠杆菌单菌落接种于2 mL LB液体培养基中，37振荡培养过夜2、按1的接种量接种于3 mL新鲜LB培养液，37剧烈振荡培养至OD600为0.4-0.6(可见雾状)3、倒至1.5mL的eppendorf管中,4下12,000 r

3、pm离心1 min，倒出培养液，用无菌滤纸尽量吸干4、加入1mL 预冷的无菌0.1molL-1 CaCl2溶液涡旋，4下12,000 rpm离心30秒,尽量去除上清5、沉淀以50-100L 预冷的0.1molL-1 CaCl2重悬，4保存备用，7d内可用。 对照处理： DNA对照处理： 无菌水代替感受态细胞，检验DNA溶液 感受态细胞对照处理： NTE缓冲液代替DNA溶液，检验感受态细胞感受态细胞有效性对照处理： 加入已知的容易转化的质粒DNA原因： 转化处理过程中，可能感染杂菌， 导致假阳性3、三亲本杂交接合转化大肠杆菌根据非接合质粒的迁移作用而建立，目前常用的载体多是在非接合型质粒或缺少了

4、接合转移基因的接合型质粒的基础上而构建的。 待转化的受体菌 含有要转化的重组质粒的供体菌 含有广泛宿主的辅助质粒的辅助菌（如：辅助菌株E. coli(pRK2013) ）4、转化率：DNA分子转化受体菌获得转化子的效率 以转化子数与用于转化处理的DNA分子数或质量的比率表示 以转化子数与用于转化处理的受体细胞数的比率表示P150影响转化率的因素： 重组DNA 分子质量较小，亲和性强，双螺旋闭合结构 受体细胞 受体细胞的选择非常重要 转化手段 电穿孔法Ca诱导法三亲本杂交法2.3 重组DNA分子导入植物细胞 (P144)（1）农杆菌介导的Ti质粒载体转化法 革兰氏阴性菌作用机制：将待转移的目的基

5、因组入农杆菌中的Ti质粒载体农杆菌识别敏感植物，将Ti质粒的T-DNA转移到植物细胞内部创伤植株感染法（植株接种共转化法）共培养感染法叶盘转化法植物愈伤组织共培养转化法植物悬浮细胞共培养转化法原生质体共培养转化法常用方法：2.4 重组DNA分子导入哺乳动物细胞 P148 磷酸钙转染法 DEAE葡聚糖转染法 聚阳离子DMSO转染法 脂质体介导法病毒介导的转染生化转染物理转染 病毒颗粒转导法 显微注射法 电穿孔法6.1 受体细胞6.2 重组体导入受体细胞6.3 重组子的筛选与鉴定第六章 DNA重组的操作6.3 重组子的筛选与鉴定（P152）重组子的筛选（选择）：经过各种方法将外源DNA分子导入受体

6、，获得所需目的重组子的过程转化子：导入外源DNA分子后稳定存在的受体细胞。重组子：含有重组DNA分子的转化子。筛选与选择 筛选（screening）：进一步检测目的重组子 通过某种特定的方法，从受体细胞群体或基因文库中，鉴定出目的重组子的过程。 选择(selection)：转化子的初步筛选 通过某种外加压力（如：抗生素）的辨别作用，呈现具有重组DNA分子的特定克隆子的一种方法。选择与筛选并无必要严格区分重组子常见的筛选方法 P1521 遗传表型直接筛选 抗药性筛选插入失活筛选法 插入表达筛选法 显色互补筛选法2 PCR法鉴定3 酶切法鉴定4 杂交法鉴定 Southern blot Northe

7、rn blot Western blot 等5 测序1、遗传表型直接筛选法根据载体选择标记初步筛选转化子 抗药性筛选插入失活筛选法 插入表达筛选法 显色互补筛选法插入失活筛选法将外源DNA片断插在BamHI位点非重组子呈 Apr、Tcr重组子呈 Apr、Tcs插入失活筛选法-过程先将转化液涂布Ap平板再将Ap平板上的转化子影印至含Ap和Tc平板在Ap平板上生长，但在Ap和Tc平板上不能生长的转化子即为重组子显色互补筛选法IPTGX-Gal-肽（LacZ）插入片段（LacZ失活）LacZ酶 MCSLacZ互补菌株X-gal + IPTG蓝白斑营养缺陷型检测法根据目的基因在受体细胞中表达产物的性质

8、，筛选阳性克隆。载体分子携带有某种营养组分的基因，而宿主细胞不能合成此营养组分，因此将转化细胞涂布在此营养缺陷型培养基上，能够生长的就是转化子2、PCR法鉴定提取质粒利用特异性引物，扩增目的序列电泳，观察结果质粒的提取小量提取（碱裂解法，NaOH/SDS）0.7%0.8%琼脂糖凝胶电泳（检测所提取的质粒的纯度和完整性）凝胶成像系统观察电泳结果质粒的提取（碱裂解法，NaOH/SDS）取1.5mL培养的克隆菌，12,000rpm离心1 min，加入预冷的100L GET悬浮沉淀，涡漩，室温静置5 min；加入200L新鲜配制的NaOH/SDS碱裂解液，上下颠倒温和混匀，置冰上5 min；加入150

9、L乙酸钾溶液中和，上下充分混匀，迅速置冰上5 min；12,000 rpm离心5 min，吸取400L上清液移入干净的离心管中；加800L 95（100）乙醇，室温放置3 min；12,000 rpm离心5 min，用1mL 70乙醇洗涤沉淀2次，真空干燥约5 min；沉淀用10-15mL TE（含10mgL-1 RNase）溶解。-20保存备用。分子克隆实验指南（第三版），科学出版社，2002。PCR鉴定提取质粒，以之作为模板进行PCR，扩增目的序列0.61%琼脂糖凝胶电泳凝胶成像系统观察电泳结果3、酶切鉴定提取的质粒为模板，双酶切，37水浴0.51h1%琼脂糖凝胶电泳凝胶成像系统观察电泳结

10、果双酶切鉴定M: DNA/ Hind+ EcoR1: HindIII和SacI双酶切后的重组克隆载体pMD18-T-RIP 1 M3530bp2027bp831bp564bp609bp凝胶电泳检测加样孔DNA Marker空质粒重组质粒 重组质粒酶切重组质粒的PCR扩增片段4、杂交法鉴定Southern blot：DNA水平Northern blot：RNA水平Western blot：蛋白质水平5、测序专业的公司进行测序拼接（将测序结果拼接出完整的序列）比对(alignment)，确定目的基因正确与否一些序列分析软件，eg. DNA star，DNAMAN，DNAClub等序列比对/BLAST(Basic Local Alignments Search Tool)最为常用的序列相似性比较的工具。用于确定未知序列与数据库序列的最佳局部比对根据序列和数据库中的序列不同类型分为5种相似性比对结果分析Bit分值：分值越高，比对