芘对斑马鱼胚胎毒性的研究

1、芘对斑马鱼胚胎毒性的研究摘 要：以斑马鱼的卵黄蛋白原（Vtg）为生物标志物，研究芘对斑马鱼胚胎毒性.用100、200和300 pig-L1 3种 不同浓度的芘和无水乙醇（空白对照）同时处理受精9 h后的斑马鱼胚胎，暴露至72 h与144 h,观察并统计斑马鱼 胚胎孵化率、死亡率以及畸形率数据以及Vtg基因表达的情况.实验结果表明：芘可以影响斑马鱼胚胎的发育，芘 的暴露导致斑马鱼胚胎出现心包水肿、卵黄囊水肿、脊柱弯曲以及尾部弯曲等中毒症状.暴露72 h和144 h后，随 着芘浓度升高斑马鱼胚胎孵化率下降，畸形率以及死亡率上升，而且中毒程度随暴露时间的延长而增加.与对照 相比，芘对斑马鱼Vtg基因

2、表达量均下降，Vtg基因均没有被显著诱导.关键词：芘；斑马鱼；胚胎；卵黄蛋白原多环芳烃类化合物（Polycyclic aromatic hydrocarbons , PAHs）的分子中含有两个或两 个以上苯环，是一类具有代表性的持久性有机 污染物（POPs）.分布在水、土壤、大气、沉 积物等各种环境介质中，在工业化程度较高地 区，例如河口、沿海港口和码头等近岸环境最 为常见，主要来自石油的开采、泄漏和污染物 排放1. PAHs具有生物蓄积性长距离迁移 和生物毒害性4-6等典型的持久性有机污染物的 属性.PAHs不仅威胁人类的生活环境和影响其 健康，而且严重威胁水生生物的生存环境. PAHs能够

3、通过食物链进入人体，干扰人体内分 泌活动的正常进行，危害人体健康7-8.在水域 生态系统中，鱼类对对污染物的毒性作用最为 敏感，组织器官和生理功能都容易受到损害. PAHs暴露可以使鱼类胚胎出现卵黄囊肿大、心 包肿大及心脏功能紊乱、脊椎弯曲、头颌发育 不全等一系列异常症状，并且影响胚胎后续发 育乃至早期仔鱼死亡率增加9-11.目前，PAHs已 被欧盟和美国环保局列为优先控制污染物，并 把其中的16种作为环境污染的监测参数12.芘是有4个苯环结构的PAHs，与PAHs有良 好的相关性，是高分子量多环芳烃的典型代 表，常作为监测的指示化合物13.对水生生物和 人体健康都有潜在毒性效应.由于具有较强

4、的疏 水性和较低的溶解度，水体中的芘主要分布在 沉积物中，成为我国淡水沉积物中重要的有机 污染物.研究证实，芘具有广泛的生物毒性，可 以对微藻14-项、桡足类生物16、贻贝17和鱼类等 产生毒性18-19.卵黄蛋白原（Vitellogenin, Vtg ）是存在于 非哺乳动物性成熟卵生雌性动物血液中的一 种蛋白质，是几乎所有卵生脊椎动物卵黄蛋白 的前体20.雌性个体在卵黄发育过程中受到雌 激素的刺激，通过肝细胞合成与分泌，随循环 系统转运到卵巢，然后裂解形成卵黄蛋白.卵黄 蛋白原可以为正在发育的胚胎提供营养和功能 性物质，是胚胎和早期幼体发育的主要营养来 源21-22.作为雌性特异性蛋白的Vt

5、g，在雄性与幼 体内含量非常低或不存在，鉴于其肝脏还具有 雌激素受体，所以在环境雌激素的诱导下，也 可以分泌Vtg.因此鱼体内Vtg水平的变化可用于 评估水环境中类雌激素化合物的污染效应.目 前，Vtg已被普遍用于环境内分泌干扰物的筛选 以及环境毒理、污染调查和相关研究中，用以检测环境中的雌激素或具有雌激素功能的化合 物23-25.斑马鱼(D anio rerio )的养殖水体小、成本 低、繁殖周期短、产卵量大、胚胎体外受精、 体外发育、胚体透明，可以在显微镜下观察 到整个胚胎发育的过程，已成为生命科学研究 的新宠22.目前，斑马鱼作为一种水生模式生 物，被广泛应用于多个科学研究领域，例如环

6、境监测、药物毒理学、生态毒理学以及疾病研 究等26-28.近年来，以斑马鱼等鱼类胚胎研究 PAHs的致畸性和作用机理29-31的相关研究逐渐 开展，大多数集中在萘、菲、苯并a芘等常见 的PAHs，对芘的研究较少.本实验研究不同浓 度芘暴露对斑马鱼胚胎生长发育及Vtg含量的 影响，以期为PAHs对水生生物的毒性提供数据 支持.1材料与方法1.1实验材料受试生物：实验用的斑马鱼(Danio rerio ) 由嘉应学院生命科学学院实验室繁育.试验药品：芘购自Sigma公司，以无水乙醇 为溶剂先配制成含有1 000 mg/L的母液，然后再 稀释成试验所需要的各浓度.RNAiso Plus (TAKAR

7、A，RNase-Free WI， USA)(TAKARADalian， ChinaDalian， China)， DNase ( RQ1DNase， Promega， Madison，First Strand cDNA Synthesis KitDalian， China )， SYBR Premix1.2斑马鱼的胚胎收集和毒性试验斑马鱼胚胎收集：挑选出健壮的性成熟斑 马鱼，在28龙恒温环境中，按照雌、雄2:3的比 例在前一天晚上放入带孵化器的玻璃缸中， 雌、雄用隔板分开，玻璃缸用黑布遮光.第二天 除去黑布，抽出隔板，以灯光照射.斑马鱼受光 照的刺激雌鱼产卵，雄鱼排精.待其产卵完成 后，去除未

8、受精的胚胎并将受精胚胎上的异物 去除，收集胚胎，在6孔细胞培养板、28龙恒温 环境下孵化.毒性试验：芘溶液对斑马鱼胚胎毒性试验 方法参照0 ECD32方法进行静态染毒.试验用6孔 细胞培养板作为染毒试验容器，根据前期预试 验，确定芘的最高耐受浓度和最低全致死浓 度，按一定比例设置0、00、200、300 pg/L 4个 浓度梯度.每个浓度设6个平行，并设对照组.随 机挑选发育正常的受精卵平均放入芘溶液中， 试验在28 C的恒温箱内进行，光周期的设定为 12 h：12 h，定时观察并记录发育过程中的毒理 学终点.每组每个浓度梯度收集15条斑马鱼仔 鱼，储存在-80 C冰箱中备用.1.3观察记录胚

9、胎的孵化率、死亡率和畸形率本试验选定的毒理学终点为胚胎发育72 h、 144 h的死亡率、孵化率和畸形率.每天至少两次 在解剖显微镜下观察胚胎发育情况，在观察过 程将肉眼看到白色或倒置显微镜下观察为黑色 的卵被判断为死亡个体，从培养板中及时挑出. 观察时尽可能在室温28 C时进行，动作迅速， 完毕后放回恒温箱中.分别在72 h和144 h统计各 实验组胚胎孵化率、死亡率和畸形率，并在显 微镜拍摄仔鱼的发育状况.1.4芘对斑马鱼胚胎目标基因表达的影响试验1.4.1提取总RNA取保存在-80 C的斑马鱼胚胎研磨成粉 末，每个样品中加入1mL Isoplus RNA ( RNAiso Plus)提取

10、液，匀浆后进行胚胎总RNA的提取. RNA提取后进行基因组DNA的去除，并用分光 光度计检测RNA的浓度及其完整性，保证 A260/A280 的比值在 1.82.1.1.4.2 cDNA的制备取一定量的RNA于离心管中，总体积为 3*L, 一组样品中以最小RNA浓度为基准.如最 小量样品中RNA含1 000 ng/pL，取3 pL，RNA含 量为3 000 ng，另一样品RNA浓度为1 200 ng/pL，则需要取样2.5 pL，另加0.5 pL 的DEPC- water.加入1pL Oligo dT试剂，手指轻弹管底混 匀，72 C热水浴10 min后将离心管放置-20 C冰 箱冷却1 mi

11、n，离心1 min.加入1 X mastermix试剂（2.5 日L dNTP ,2日L FS buffer ,1 日LDTT, 0.5L MMLV反转录酶等试剂的混合物， 混匀）.42 C水浴中孵育2 h. -80 C保存备用. 1.4.3 PCR 扩增引物稀释10倍，10叽的引物加入90日L的 UPW-water.将反转录获得的cDNA样品稀释 10倍，直接在获得的样品中加入90叽的UPW- water. 准备32支0.2 mL PCR管，总反应混合体系 体积为30 pL,依次添加以下试剂：cDNA样品 10*L, ddH2O 15.8*L, 10 xBuffer 3 pL，primer1

12、 （上游引物）0.3 pL，primer 2 （下游引 物）0.3 *L, Taq酶0.6 *L,混匀.进行PCR反 应检测，设定PCR程序，基因V tg1、Vtg3- Vtg8反应条件为94 C 3 min预变性,94 C 30 s 变性，57 C 30 s退火，72 C 40 s延伸，72 C 5 min,12 C 5 min, 33个循环；efla基因反应条件为94 C预变性5 min, 94 C变性30 s, 61 C 退火 30 s, 72 C延伸30 s, 72 C 7 min, 12 C 5 min, 33个循环.如若扩增完成后不及时进行下一步实 验，将样品放置4 C冰箱冷藏备用

13、.1.4.4电泳鉴定进行琼脂糖凝胶电泳.称取0.6 g琼脂糖粉， 加到40 mL 1xTBE电泳缓冲液中，摇匀，在微 波炉中加热1分钟，待琼脂糖完全溶解后取出. 冷却至60 C左右，加入5 pL Gold View核酸染 料，轻轻摇匀，以避免产生气泡.冷却至不烫手 时倒胶，室温下冷却凝固，小心地向上垂直拔 出梳子，将凝胶放入电泳槽中，加1xTBE电泳 缓冲液，直到液体表面覆盖凝胶5 mm左右.用 移液枪分别吸取各浓度组10 pL DNA样品置于保 鲜膜上，另外再吸取1.5 pL green buffer缓冲 液，然后与样品反复吹吸混匀.吸取5 p L marker试剂和8 pL混合好的样品小心

14、地加入点样 孔.打开电源开关，将调节电压至110 V-120 V,电泳约15 min20 min.根据紫外光下的观察 结果，用凝胶图像分析系统对电泳条带进行 PCR定量分析.1.5数据处理所有的实验重复4次,用2- A A Ct法结合定 量PCR数据计算基因的相对表达量，实验结果 用平均值土标准误差（mean SDE）表示.采用 SPSS17.0统计；分析软件对实验数据进行统计 分析，使用单因素方差分析（ANOVA）法和 Duncan多重比较法对实验所得的数据进行比 较，观察暴露组和对照组间各观测指标的是否 存在显著性差异，其差异性用字母标记统计值 的方法来表示，同一个字母表示数值间差异不 显

15、著（P0.05）,不同的字母则表示数值差异 显著（P0.05 ）.2结果与分析2.1芘暴露对斑马鱼胚胎及幼鱼形态学的影响芘溶液对斑马鱼胚胎毒性试验中发现，对 照组的斑马鱼胚胎发育正常，芘溶液对斑马鱼 胚胎和仔鱼产生各种毒性效应，如图1所示.从 图可见，芘溶液暴露处理后，斑马鱼胚胎以及 幼鱼出现心包水肿、卵黄囊水肿、脊柱弯曲和 尾部畸形等不同程度发育异常症状，甚至有死 亡现象，死亡胚胎呈白色不透明状.D卵黄囊肿大E心包水肿、卵黄囊肿大F心包水肿、卵黄囊肿大G脊柱、尾部弯曲H脊柱、尾部弯曲I脊柱弯曲图1芘暴露对斑马鱼胚胎形态变化及中毒症状注：PCE表示心包水肿，YSE表示卵黄囊肿大，SC表示 脊柱

16、弯曲，TC表示尾部弯曲2.2芘暴露对斑马鱼胚胎死亡率、孵化率及畸 形率的影响芘溶液对斑马鱼胚胎毒性试验中，其胚胎 发育72 h、144 h的死亡率、孵化率和畸形率如 表1所示.随着芘的质量浓度加大，斑马鱼的孵 化率下降，在初始质量浓度1。- L-1时，孵 化率为(75.0。 2.73 ) %，与对照组(78.57 1.65 ) %相比差异无统计学意义(P0.05)；在 中浓度组2。g - L-1时，孵化率为(67.14 1.65 ) %，与对照组差异显著(PG.G5 )；在最 高质量浓度3。g - L-1时，孵化率为(61.43 3.69)%，与对照组差异显著，各实验组间孵化 率也存在显著差异

17、.芘的质量浓度与斑马鱼胚胎和幼鱼的畸形 率以及死亡率呈正相关，而且随着时间的延 长，畸形率和死亡率升高.在初始质量浓度1。 g - L-1时，72 h和144 h畸形率分别为(5.。 4.3。)和(27.744.64)%，均与对照组(。.。.。) %差异显著；在中浓度2。 日g - L-1时，72 h和144 h畸形率分别为(1。.。土 2.72) %和 ( 41.67 1.92 ) %，均与对照组有 显著差异；在最高浓度组3GG g - L-1时的72 h、144 h两者畸形率分别为(18.341.92 ) %和(46.55 4.83 ) %，均与对照组有 显著差异.芘溶液最低浓度组的斑马鱼

18、幼鱼在72 h的 死亡率是(3.34 3.85 ) %，与对照组(2.5。 3.19 )无显著差异，但在144 h时的死亡率 (27.5G6.31 ) %与对照组(1。.。2.72 ) %存在显著差异；中浓度组的幼鱼在 72 h的死亡率是(4.17 3.19 ) %，与对照组 无显著差异，但在144 h时的死亡率(35.GG 4.3G) %与对照组有显著差异；最高浓度 组的幼鱼在72 h和144 h的死亡率分别是(8.34 1.92) %和(4G.83 5.69) %，均与 对照组差异显著.表明低浓度时对斑马鱼胚胎 发育影响较小，高浓度对斑马鱼发育产生较大 影响.表1芘暴露对斑马鱼发育的毒性影

19、响质量浓度/孵化菊畸形豹死亡豹(上旷匚)72 h 144 h 72 h144 h078.57 1.651 0.00 0.001 0.00 0.002.50 3.1910.00 2.7210075.00 2.73 5.00 4.30 27.74 4.643.34 3.85127.50 6.31b20067.14 1.65b 10.00 2.72141.67 1.924.17 3.1935.00 4.3030061.43 3.69 18.34 1.92d 46.55 4.838.34 1.92k40.83 5.69c注：结果为每组4个重复的平、均值士标准误差(mean 士 SDE )表示，同一列不

20、同字母表示组间差异 显著(P0.05 )2.3芘暴露对卵黄蛋白原(Vtg)基因表达的影响芘溶液对斑马鱼胚胎毒性试验。、1。、2。、3GG ug/L 4个浓度梯度.如图2所示，与对照 组相比，芘暴露对卵黄蛋白原(Vtg)基因 Vtg1、Vtg3、Vtg5和Vtg7基因表达诱导显示总体 呈现下降的趋向，Vtg4和Vtg6基因随着芘浓度 的升高，基因表达量增加，但各浓度组的表达 量均较对照组下降.对照组中Vtg1基因表达量为1.2。，Vtg1在 各浓度组的基因表达量分别为。.36、。.23、。.12. 与对照组相比，Vtg1基因表达量均降低；且各 浓度组之间随着芘溶液浓度的升高而下降，均 有显著差异

21、(？。.。5),各平行实验组间没有 显著差异.对照组中Vtg3基因表达量为1.83, Vtg3在各 浓度组的基因表达量分别为。.6。、。.43、G.39. 与对照组相比，Vtg3基因表达量均降低；且各 浓度组之间随着芘溶液浓度的升高下降， Vtg3基因没有被芘诱导.对照组中Vtg4基因表达量为1.31, Vtg4在 各浓度组的基因表达量分别为。.38、。.45、。.49. 与对照组相比，Vtg4基因表达量均降低；但各 浓度组之间随着芘溶液浓度的升高而Vtg4基因 表达量上升，但不显著.对照组中Vtg5基因表达量为1.62, Vtg5在各 浓度组的基因表达量分别为。.66、。.34、G.16.

22、与对照组相比，Vtg5基因表达量均降低；且各 浓度组之间随着芘溶液浓度的升高而下降， Vtg5基因没有被芘诱导.对照组中Vtg6基因表达量为1.。9,Vtg1在各浓度组的基因表达量分别为。.4。、。.96、1.。2.与对照组相比，Vtg6基因表达量均降低；但各 浓度组之间随着芘溶液浓度的升高而Vtg6基因 表达量上升，Vtg6基因没有被芘显著诱导.对照组中Vtg7基因表达量为1.17, Vtg7在 各浓度组的基因表达量分别为0.41、0.35、0.20. 与对照组相比，Vtg7基因表达量均降低；且各 浓度组之间随着芘溶液浓度的升高而下降，均 有显著差异（PV0.05）,各平行实验组间没有 显著

23、差异.芘质量浓度Z（g-L芘质量浓度Z（g-L-1）*招糕其rgKw混-A1.801.601.401.201.000.800.600.400.20芘质量浓度/ （片g300CTL1002001.601.401.201.000.800.600.400.20200300CTL100芘质量浓度/ （ug 芘质量浓度/ （片g300CTL1002001.601.401.201.000.800.600.400.20200300CTL100芘质量浓度/ （ug -L1）0.201.400.00CTL1002003000000000000864208642011111 0. 0. .0 0. 0. *招糕其

24、rgKws81ACTL100200300芘质量浓度Z（g-L_1）芘质量浓度Z（1.400.00CTL1002003000000000000864208642011111 0. 0. .0 0. 0. *招糕其rgKws81ACTL100200300芘质量浓度Z（g-L_1）芘质量浓度Z（g-L_1）00000004208642111 0. 0. 0. 0. *招糕其rgKw981A1.201.000.800.600.400.20.CTL100200300芘质量浓度Z（g-L_1）图2芘暴露对卵黄蛋白原基因表达的影响本实验研究了芘暴露72h、144 h的斑马鱼 胚胎生长发育情况，运用荧光定量PCR测定斑 马鱼胚胎期Vtg含量，结果表明：与对照组相 比，除了 100 pg-L-1浓度组外，斑马鱼胚胎孵 化率显著下降，畸形率增加，死亡率上升；而 72 h和144 h相比，中毒的程度随暴露时间的延 长而加重低浓度芘溶液在斑马鱼胚胎或幼鱼体 内沉积量低，产生的毒性相应较低；然而随着 溶液中芘含量的升高，斑马鱼胚胎及其幼鱼体 内芘的沉积量增加，大大降低了斑马鱼的胚胎 孵化率，加重了心包水肿、