TIMP4基因的克隆、原核表达及活性测定

1、TIMP-4基因的克隆、原核表达及活性测定【摘要】目的:采用RT-PR法获取TIP-4基因，并通过原核表达获取具有生物活性的TIP-4交融蛋白。方法:从SD大鼠心肌组织中提取总RNA，利用RT-PR法扩增出TIP-4基因，经基因序列分析后构建表达载体PET-28a(+)-TIP-4，转化大肠杆菌BL21，IPTG诱导TIP-4的表达。利用N2+-NTA纯化和复性后，根据其骨肉瘤细胞迁移才能的影响检测其活性。结果:克隆到编码序列完全正确的大鼠TIP-4基因，能在大肠杆菌中获得高效表达，表达产物占全菌总蛋白的23.5%，N2+-NTA纯化和复性后，纯度达90%以上。纯化后的交融蛋白使骨肉瘤细胞株的

2、迁移才能得到显著抑制。结论:通过基因克隆和原核表达的方式可以大量获得具有生物活性的TIP-4交融蛋白。【关键词】TIP-4基因克隆基因表达免疫活性Abstrat:bjetive:TextratthegenefTIP-4ithRT-PRethdsandbtainthebiativeratTIP-4fusinprtEinexpressedinE.li.ethds:TtalRNAasextratedfrardiauslefSDrat.TIP-4geneasbtainedandaplifiedithRT-PRethd.Theislatedfragentassequened,rebinedithplas

3、idpET-28a(+)atERIandHindsitesandtransfredintE.liells.TheexpressinfTIP-4asinduedbyIPTG.TIP-4prteinaspurifiedandrenaturalizedbyN2+-NTA.Theapabilityfinhibitingigratinfstesaraelllineasusedasaeasuretassayitsviability.Results:TheTIP-4geneftherat,hihaslnedandrretlyded,uldbehighlyexpressedintheE.listrain.Th

4、eexpressedprdutftheTIP-4auntedfr23.5%fthettalbaterialprtein.TheTIP-4auntedfratleast90%afterN2+-NTApurifiatin.ThepurifiedTIP-4prteinuldsignifiantlyinhibittheigratinfstesaraellline.nlusin:TIP-4fusinprteinithbiativityanbebtainedprfuselybygenelningandexpressininE.li.Keyrds:TIP-4;genelne;expressin;viabil

5、ityassay目前对恶性肿瘤的治疗尚缺乏非常有效的措施，其主要原因在于肿瘤具有侵袭、转移和基因变异等特性，对肿瘤侵袭转移机制方面的研究成为肿瘤治疗的关键。组织基质构造的破坏和肿瘤新生血管的形成是肿瘤生长、转移得以实现的先决条件。基质金属蛋白酶atrixetallprteinase，P为一类蛋白水解酶家族，它能降解多种胶原蛋白、纤维连接蛋白和弹性蛋白等血管基膜和基质构造，为肿瘤的生长、转移创造适宜的环境。金属蛋白酶组织抑制剂tissueinhibitrfatrixetallprteinase，TIP的发现是肿瘤研究上的一大打破，它是P的天然抑制剂，目前根据发现的时间顺序分别称为TIP14。国内

6、外对于TIP-4的功能已经有了一些研究，但结果有所差异。Jiang等1的研究发现，TIP-4可以抑制乳腺癌细胞的凋亡，而更多的实验说明TIP-4为肿瘤生长的抑制因素2，3。为进一步开展对TIP-4在骨肉瘤和软骨肉瘤方面的作用及其机制的研究，以及对其在其他领域的功能，本实验采用分子生物学的基因克垄表达和纯化等手段，力求获取具有生物活性的TIP-4交融蛋白，为以后的研究打下基矗1资料和方法1.1材料1.1.1组织来源：成熟SD大鼠由第二军医大学实验动物中心提供。1.1.2菌种、质粒和细胞：大肠杆菌TG1、BL21(DE3)、pBluesriptSK(+)质粒、表达质粒pET-28a(+)均由第二军

7、医大学神经生物学教研室提供。骨肉瘤细胞株购自中国科学院上海细胞生化研究所。1.1.3试剂：RNA抽提试剂盒为上海化舜生物工程产品。RT-PR试剂盒为Qiagen公司产品。PyrbestDNA聚合酶为Takara公司产品。限制性核酸内切酶、T4DNA连接酶为BI公司产品。质粒抽提和胶回收试剂盒为Vigene公司产品。异丙基-D-硫代半乳糖苷酶IPTG为上海生工公司产品。Ni2+-NTA柱为Siga公司产品。1.2方法1.2.1RT-PR1.2.1.1总RNA的提取：取成熟SD大鼠心肌组织约150g，参考萨姆布鲁克等4方法及RNA抽提试剂盒手册，电动匀浆后行总RNA的提龋1.2.1.2DNA的合成

8、：参考RT-PR试剂盒实验手册进展。RNA(1g/l)2.0l，dNTPs(5dNTP)2.0l，lig-dT引物10unit/l1.0l，RNase抑制剂10unit1.0l，逆转录酶4unit1.0l，无RNase水加至20l。37温育60in，然后90温育5in使逆转录酶失活。-20保存。1.2.1.3PR扩增：参考GeneBank(gi:48255910)发表的序列及表达载体pET-28a(+)多克隆位点、应用DNAstar软件设计引物，由上海生工公司合成。上游引物：5TGGAATTATGTGGGAGT3ERI下游引物：5GAAAGTTGATATTGGTATG3HindIII取逆转录产

9、物2.0l为模板，按常规PR反响条件，先将样品于94变性5in，参加2.5u的PyrbestDNA聚合酶，按以下参数循环35次：94变性1in，58退火1in，72延伸40s，最后一个循环后，72延伸10in，4保存。1.2.3载体的构建及DNA序列分析：将RT-PR产物平端与用ER酶切过的pBSK(+)质粒，回收后转化大肠杆菌TG1，挑白斑培养抽提质粒并进展初步酶切鉴定，选择3株酶切合格质粒送生工公司测序。把测序正确的质粒用ERI和Hind双酶切，胶回收后与预先经ERI和Hind双酶切的表达载体pET-28a(+)在连接酶作用下相连接，构建T7启动子控制下的TIP-4表达质粒见图1。将pET

10、-28a(+)-TIP-4表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)。1.2.4重组克隆的诱导表达、纯化和复性及鉴别：将pET-28a(+)-TIP-4表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，接种单菌落至3lLB培养液中37培养过夜，按2%的比例转接于LB培养液中含50g/l的卡那霉素，37培养至A600条件下为0.61.0，参加IPTG终浓度为1/L，诱导35h，离心搜集菌体，进展SDS蛋白电泳，薄层扫描检测TIP-4的表达情况。诱导表达菌经超声破碎后，搜集包涵体，用洗涤缓冲液洗涤，500l菌液制备的包涵体溶于20l溶解缓冲液。溶解后的蛋白用结合缓冲液透析24h后进展纯化。由于TIP-4的N端交

11、融了6His，所以表达产物以Ni2+-NTA树脂来纯化。溶解的蛋白上预先以3倍柱体积结合缓冲液平衡的Ni2+-NTA柱后，先以10倍结合缓冲液洗涤，再分别以10倍柱体积的NTA-PH6.5Buffer和NTA-PH5.80Buffer洗脱杂蛋白。直接在Ni2+-NTA柱上复性5。先用10倍柱体积的复性缓冲液A洗涤，再用15倍柱体积的复性缓冲液B洗涤。最后用洗脱缓冲液洗脱目的蛋白。纯化的TIP-4经蛋白质浓度测定后，-70保存。esternblt分析鉴别：用10%丙烯酰胺凝胶进展SDS电泳(每孔加TIP-4纯化交融蛋白20l)，电泳后将蛋白转移至硝酸纤维膜上，切取条带后在4条件下以的TIP-4单

12、克隆抗体(1:100Siga)孵育24h，漂洗后以带有辣根过氧化物酶的二抗37孵育30in，4-氯-1-萘酚Siga显色。1.2.5实验操作方法：质粒抽提、酶切反响、DNA片段回收、连接反响、细菌转化、SDS电泳等实验操作均参照文献4略加修改良行。1.2.6TIP-4蛋白对骨肉瘤细胞侵袭性影响的测定(微孔迁移技术)：Byden小室的构建参照hyeldinA等6方法。用DE制备浓度为2105个/l的骨肉瘤细胞悬液，分成两组：1组为对照组，另1组含浓度为20g/l的TIP-4蛋白，向小室中各参加细胞悬液100l，37孵育24h后将小室置于4%中性甲醛中固定20in，存在于微孔滤膜上面的细胞用棉签蘸

13、95%乙醇轻轻擦去，侵袭至膜下的细胞用苏木精和5%结晶紫染色，膜枯燥后用剪刀将膜剪开，置于玻片上中性树胶封片并计数，每张膜取上、下、左、右、中5个视野，取均数，每种处理分别重复3次。取穿过膜的细胞相对数作为衡量细胞侵袭才能的指标，计算方法为：侵袭力=1-实验组侵袭细胞数/对照组侵袭细胞数100%。1.3统计学处理方法采用t检验进展统计检验。2结果2.1TIP-4基因的获得新生4dSD大鼠心肌细胞组织总RNA，经甲醛变性电泳，紫外检测仪下可见完好的28s，18srRNA，说明提取的总RNA质量可靠，未出现降解。RT-PR扩增得到大小约680bp的特异条带，大小与预测结果一致见图2。回收此片段平端

14、克隆入载体pBSK(+)，转化感受态TG1，挑取重组子，经ERI和Hind双酶切鉴定，琼脂糖电泳见图3，说明插入片段大小与预测大小一致。对重组质粒中插入片段测序，结果说明别离的TIP-4基因序列与GeneBank(gi:48255910)发表的序列一致。2.2TIP-4的诱导表达、纯化及复性采用IPTG诱导表达后发现，在分子量约23kD处有显著的蛋白表达条带，该蛋白大小与理论计算值根本一致，凝胶自动扫描分析显示，其占BL21细菌总蛋白的23.5%，根本是以包涵体形式存在。将大量诱导的BL21细菌超声破碎、洗涤、溶解、纯化、复性后，经SDS电泳，考马斯亮蓝染色分析，除TIP-4特异条带外，根本无

15、其他条带，薄层扫描结果可见纯度达90%以上，详见图4、图5。经过esternblt分析后显示所获得的蛋白质与TIP-4抗体具有特异性作用，为TIP-4蛋白见图6。2.3TIP-4的活性测定atrigel经过重建后在聚碳酸酯膜外表形成类似天然基底膜构造，对其的侵袭才能可以显示出肿瘤细胞的侵袭力。本研究中显示，TIP-4交融蛋白使骨肉瘤细胞侵入基底膜才能受到明显影响，浸入的细胞数为61.35.2对照组为80.57.6，其抑制率到达25.1%(见表1)。3讨论TIP-4是1996年JhnGreene等7采用已表达序列标志(expressedsequenetag，EST)序列测定的方法研究P的抑制物T

16、IP时发现的，属于TIP家族成员中的一员，根据发现的先后顺序而被命名为TIP-4。后来通过免疫组化、Nrthen-Blt，RT-PR及原位杂交等方法来研究发现，TIP-4的组织表达相当局限，在肾脏、胰腺、结肠及直肠中的表达量非常低，在肝脏、脑、肺、甲状腺、小肠等组织中根本无表达，但在心脏有大量的转录和翻译。鉴于此，我们选择用成熟SD大鼠的心肌细胞作为基因的组织来源，参考GeneBank(gi:48255910)发表的序列，应用DNAstar生物软件设计引物，用RT-PR方法别离到了TIP-4目的基因，经序列测定显示别离得到的TIP-4目的基因与文献报道一致。这意味着在SD大鼠的心肌细胞中确实有

17、TIP-4RNA表达，并且该研究中所采用的引物设计正确且条件适宜。研究中把别离到的目的基因克隆至pET-28a(+)表达载体，以大肠杆菌BL21为宿主菌进展表达，发如今BL21中TIP-4的表达量可占全菌总蛋白的23.5%，且根本上是以包涵体的形式存在。由于TIP-4的N端交融了6His，所以表达产物在溶解后采用N2+-NTA柱来纯化。本研究中采用直接在N2+-NTA柱上进展复性，使传统的透析复性、稀释复性等方法存在的效率低、损失量大的缺点得到了很大的克制。用获得的TIP-4蛋白参加培养基中发现，TIP-4蛋白对骨肉瘤的侵袭力产生了较大的影响，抑制率到达25.1%，这意味着所获得的TIP-4蛋

18、白具有抑制骨肉瘤侵袭才能的生物学活性，从而为后续的TIP-4的构造和功能研究提供了基矗【参考文献】1蒋晓山,黄信孚,李吉友,等.金属蛋白酶组织抑制物与乳腺癌转移及预后的关系J.中华外科杂志,2000,38(4):291-293.2FisherKE,PpA,Kh,etal.Turellinvasinfllagenatriesrequiresrdinatelipidagnist-induedG-prtEinandebrane-typeatrixetallprteinase-1-dependentsignalingJ.laner,2022,5(12):69.3aJ,hiarelli,KzarekarP,etal.ebranetype1-atrixetallprteinaseprteshuanprstateanerinvasinandetastasisJ.ThrbHaest,2022,93(4):770-778.4萨姆布鲁克J,弗里奇EF,曼尼阿蒂斯T主编.金冬雁,黎孟枫主译.分子克隆实验指南.北京:科学出版社,1999:16-87.5FrankenKL,HiestraHS,vaneijgaardenKE,etal.Puri-fiatinfhis-taggedprteinsbyibilizedhelateaffin-ityhratgraphy: