生物药物分析与检验 电泳分析法课件

1、电泳分析法金叶1 1807-1809年，俄国物理学家F.F.Reuss首次发现黏土颗粒的电迁移现象，并开始研究带电粒子在电场中的电迁移行为，测定它们的迁移速度。电泳的发展 1907年，Field 和Teague研究出填充有琼脂糖凝胶的桥管，成功地分离了白喉毒素和它的抗体。*2 1937年，蒂塞利乌斯（ Tiselius，瑞典)将蛋白质混合液放在两段缓冲溶液之间，两端施以电压进行自由溶液电泳，第一次将人血清提取的蛋白质混合液分离出白蛋白和、球蛋白；发现样品的迁移速度和方向由其电荷和淌度决定。 第一次的自由溶液电泳；第一台电泳仪； 1948年，获诺贝尔化学奖。*3 1959年，Raymond和We

2、intraub利用人工合成的凝胶作为支持电解质，创造了聚丙烯酰胺凝胶电泳，极大地提高了区带电泳的分辨率。*4一、定义及原理1、电泳：是指带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动的现象。2、原理 电泳技术就是利用在电场作用下，根据待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、性状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯。 3、应用：电泳技术除了用于小分子物质 (无机盐、氨基酸、核苷酸、脂类)的分离分析外，最主要用于生物大分子 (蛋白质、核酸、酶) 的研究。二、电泳分类 （一）按有无固体支持物分类按有无固体支持物可以分为两类：自由界面电泳和支持物电泳。1、自

3、由界面电泳即溶质在自由溶液中泳动，包括：等电聚焦电泳、等速电泳等。2、支持物电泳根据所用的支持物不同又可分为纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。3、根据支持载体的位置或形状可分成：水平电泳、垂直板式电泳、垂直柱式电泳、U型管电泳、毛细管电泳等。 1、自由界面电泳 2、区带电泳 3、高效毛细管电泳（二）按分离原理分类区带电泳： 是在溶液中加入一些惰性物质或凝胶物质作为支持物，泳动物质在支持物间隙中移动的电泳方法。 避免对流的干扰。纸电泳醋酸纤维素电泳琼脂糖电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 DNA序列分析电泳槽中型双垂

4、直电泳槽1、区带电泳基本理论在众多电泳技术中，最常用的为区带电泳，同时也是最简洁的电泳模式。推动离子/粒子作区带电泳的驱动力为电场力（F），离子/粒子所受电场力的大小与离子/粒子的净电荷（Q）和电场强度（E）呈正比关系，即： 而离子/粒子在运动时会受到一定的溶液阻力（F），对于球形离子/粒子，此阻力服从Stoke定律，即 在上式中，r为离子/粒子的半径，为溶液或介质的黏度，v为粒子运动速度。 F=6rv当电泳达到稳态时，电动力等于介质的阻力，即F=F。因此，我们得到 v/E表示迁移率，也称淌度，以U表示 带电粒子的电泳淌度在一定条件下取决于粒子本身的性质，即与其所带电量成正比；与其半径及介质粘

5、度成反比。QE=6rvv/E=Q/6rU=v/E=Q/6r影响电泳迁移率的因素(必考)：1、影响电泳迁移率的外界因素：电场强度溶液的pH值溶液的离子强度电渗现象溶液的温度和黏度分子筛效应2.影响电泳迁移率的内在因素：质点所带净电荷的量质点的大小和形状指用滤纸作为支持载体的电泳方法。是最早使用的区带电泳。 平卧式电泳槽装置示意图 将滤纸条水平地架设在两个装有缓冲溶液的容器之间，样品点于滤纸中央。当滤纸条被缓冲液润湿后，再盖上绝缘密封罩，即可由电泳电源输入直流电压（100V1000V）进行电泳。 （一）纸电泳醋酸纤维薄膜电泳以醋酸纤维薄膜为支持介质。醋酸纤维素是纤维素的醋酸酯，由纤维素的羟基经乙酰

6、化而成。它溶于丙酮等有机溶剂，可涂布成均一细密的微孔薄膜，即醋酸纤维素膜（cellulose acetate membrane，简称CAM）。(二) 醋酸纤维素薄膜电泳优点：精确性高。快速省时。一般电泳45-60min即可。 灵敏度高，样品用量少。 应用面广。如胎儿甲种球蛋白，溶菌酶，胰岛素，组蛋白等用醋 酸纤维薄膜电泳能较好地分离。 有利于扫描定量及长期保存。 缺点：分离效果不太好。优缺点醋酸纤维素薄膜电泳示意图（1）预处理 膜的准备：根据分离样品的多少将醋酸纤维薄膜裁切成合适的大小，在膜片无光泽的一面上用铅笔轻轻划一条加样线。加样线可选在距膜片一端23cm处，有时也可选在膜片的中央线附近。

7、膜片浸透：在一浅碟或培养皿中倒入所选择的缓冲液，将膜片小心地浮铺在缓冲液面上，将膜片的的无光泽面朝下。膜片的底面吸收电极缓冲液后逐渐下沉，直至电极缓冲液将膜片完全浸透。膜片在电极缓冲液完全浸透后，用钝头镊子取出，稍稍用滤纸吸去多余的缓冲液，然后将膜片夹在两层滤纸之间吸干多余的缓冲液，但不能吸得过干而出现不透明的白色部分。实验操作步骤 （3）电泳 电泳前，先用钝头镊子将加过样的膜片安放在电泳槽的支架上，膜片两端约0.51.0 cm的部分应与支架的顶面紧贴，膜面尽可能不与手指直接接触，以免膜面受到污染。如果在同一电泳槽内同时安放几张膜片，应避免相邻膜片之间彼此接触。在电泳槽的两个电极室内注入适量的

8、电极缓冲液，用3 4层滤纸作盐桥。膜片的两端分别用滤纸盐桥盖住，以此将膜片拉平固定并使电流通过。盖上电泳槽盖，让膜片在电泳槽内水平静置平衡10分钟，然后将电泳槽的两个电极与直流电源的正负极分别相接。架膜加盖接导线，开机染色剂要求：不应溶解醋酸纤维薄膜一般蛋白质的染色方法氨基黑10B染色：酸性染料，其磺酸基与蛋白质反应构成复合盐，是最常用的蛋白质染料。丽春红S方法：是一种水溶性的阴离子重氮染料，带负电荷的丽春红分子与正电荷的蛋白质氨基基团结合，也可以非共价键形式与蛋白质非极性区域结合，显示红色蛋白条带。用3%三氯醋酸配制0.2%丽春红S溶液，将干燥的膜片浸入此染色剂中。染色时间不需要严格控制，但

9、一般染色10分钟比较合适。（4）染色 （6）定量测定定量测定的方法有洗脱法和光密度法。洗脱法是将确定的样品区带剪下，用适当的洗脱剂洗脱后进行比色或分光光度测定。光密度法是将染色后的干滤纸用光密度计直接定量测定各样品电泳区带的物质含量。 醋酸纤维薄膜电泳应用范围较广，可用于检测和分析血清蛋白、脂蛋白、糖蛋白、体液、脊髓液、脱氢酶、多肽、核酸以及其他生物大分子物质。由于醋酸纤维薄膜电泳法快速且简便，目前在医学和临床生物化学等领域已成为一种常规技术。应用人血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳 原理：以醋酸纤维薄膜为支持物，在pH=8.6的巴比妥缓冲液中，人血清蛋白的pI均小于8.6，带负电荷，电泳时向正极移动。

10、由于迁移率不同而被分离。人血清蛋白质的等电点和迁移率概念：以琼脂糖凝胶作支持体的电泳方式。(三)琼脂糖凝胶电泳天然琼脂（agar）:又名琼胶、菜燕、冻粉，从石花菜及其它红藻类植物提取出来的一种线状高聚物。琼脂糖（agarose）琼脂胶（agaropectin） 天然琼脂(agar)是一种多聚糖，主要由琼脂糖(约占80%)及琼脂胶组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷。而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象，加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离效果。 琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳，其优点如下： (1)琼脂糖

11、凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可进行电泳。 (2)琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大(约占98-99%)，近似自由电泳，样品扩散度较自由电泳小，对样品吸附极微，因此电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。 (3)琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外光灯监测及定量测定。 (4)电泳后区带易染色，样品易洗脱，便于定量测定。制成干膜可长期保存。 琼脂糖凝胶电泳的缺点：(1) 机械强度差，易破碎，浓度不能太低。(2) 易被细菌污染，不易保存，临用前配制。(3) 琼脂糖支持层上的区带易于扩散，电泳后必须立即固定染色。(4) 与PAGE相比，分子筛作用小，区带少。 目前，琼脂糖凝胶电泳常

12、用于分离、鉴定核酸，如DNA鉴定，DNA限制性内切酶图谱制作等。由于这种方法操作方便，设备简单，需样品量少，分辨能力高，已成为基因工程研究中常用实验方法之一。 琼脂糖也可用作为电泳支持物，分离蛋白质和同工酶。将琼脂糖电泳与免疫化学相结合，发展成免疫电泳技术，能鉴别其他方法不能鉴别的复杂体系，由于建立了超微量技术，0.1g蛋白质就可检出。 (四) 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶是由丙稀酰胺（acrylamide，简称Acr）和亚甲基双丙稀酰胺(N，N- methylenebisacrylamide，简称Bis)聚合而成的，具有一定的网状结构。在形成凝胶的化学聚合过程中，可以人为控制聚合成具有一

13、定大小孔径的凝胶。在电泳过程中，净电荷相近的物质在通过凝胶孔洞时，所受到的阻力和样品分子的大小和形状密切相关，即分子筛作用。原理电泳不仅能分离含有各种大分子物质的混合物，而且可以研究生物大分子的特性。诸如如电荷、分子量、等电点以至于构象。在恒定的、非解离的缓冲系统中来分离蛋白质，属于非解离电泳。在电泳过程中仍然保持蛋白质的天然构象、亚基之间的相互作用及其生物活性，因而根据其电泳迁移率，可得到天然蛋白质的分子量。 聚丙烯酰胺凝胶电泳原理PAGE的特点1.具有分子筛效应，分辨率高2.样品不易扩散，用量少，灵敏度可达10-6g3.化学性质稳定，分子结构中富含酰胺基具有稳定的亲水基团4.凝胶不带电荷，

14、消除了电渗现象5.机械强度好，有弹性，在一定浓度范围内无色透明6.网孔可调节。聚丙烯酰胺凝胶胶体的制备示范PAGE 垂直板式电泳PAGE应用范围较广，可用于脱辅基蛋白的分离、cDNA合成产物的分离、DNA片断的分离制备、DNA顺序分析、生物大分子分子量的测定、及RNA序列分析等。应用例1：玉米改良单交种的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。不同玉米种子清蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果。条件：分离胶T = 13.8%， 浓缩胶T = 4.9%，清蛋白样品16 加样， 电压 300350 V 1015 min 后将电压逐渐升至500 V 并稳压电泳4045 min，考马斯亮兰R250 染色5 min。十二烷基磺

15、酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS），简称 SDS电泳，主要用于测定蛋白质分子量研究。(五) 十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳在聚丙烯酰胺凝胶中加入阴离子表面活性剂十二烷基磺酸钠（SDS），不影响凝胶的形成，不影响蛋白质的电泳迁移率，蛋白质的电泳迁移率主要取决于其自身分子量的大小。SDS能打开蛋白质分子间的氢键和疏水键，使蛋白质变性成为松散的线状(缓冲液中加入巯基乙醇)。 同时大多数蛋白质的每个氨基酸能与固定量的SDS相结合 ，形成SDS蛋白质复合物。蛋白质分子与SDS充分结合后

16、，所带上的SDS负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而也就掩盖或消除了不同种类蛋白质分子之间原有的电荷差异。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳具有设备简单，样品用量甚微，操作方便等优点，现已成为测定大多数蛋白质分子量的常用方法。免疫电泳是琼脂平板电泳和双相免疫扩散两种方法的结合。将抗原样品在琼脂平板上先进行电泳，使其中的各种成分因电泳迁移率的不同而彼此分开，然后加入抗体做双相免疫扩散，把已分离的各抗原成分与抗体在琼脂中扩散而相遇，在二者比例适当的地方，形成肉眼可见的沉淀弧。（六）免疫电泳(七)高效毛细管电泳法（HPCE） 传统电泳最大的局限性是难以克服由两端的高电压所引起的电介质离子流的自热，或

17、称焦耳热, 从而导致区带展宽，影响迁移，降低效率, 因此极大地限制了高压的使用.当然也就难以加快整个过程的速度。 45 毛细管电泳（ capi1lary electrphoresis，CE）和传统电泳的根本区别在于前者设法使电泳过程在散热效率极高的毛细管内进行，从而确保引入高的电场强度，全面改善分离质量。46l967年Hjerten最先提出在高电场强度，直径为3mm的毛细管中作自由溶液的毛细管区带电泳，开创了CE的先河。1981年，J.W.Jorgenson,K.D.Lukacs实验上和理论上为毛细管电泳的发展奠定了基础。198889年，商品化的毛细管电泳仪推出，毛细管电泳法迅速发展起来。 第

18、一节 毛细管电泳的特点和分类一、电泳和色谱1.分离原理47 电泳是溶液中带电粒子在电场力作用下发生定向运动，因粒子所带电荷数、形状、大小等不同，导致不同的迁移速度而分离。 色谱是不同组分在流动相的推动下，由于在固定相流动相中的分配系数不同，导致不同的迁移速度而分离。某些毛细管电泳的分离模式也包含了色谱的分离机制。2.分离过程 电泳和色谱的分离过程都是差速迁移过程，可用相同的理论来描述。色谱中所用的一些名词概念和基本理论，如保留值、塔板理论、速率理论等均可借用于毛细管电泳中。483.仪器流程49二、毛细管电泳的特点1. 柱效高 高效毛细管电泳的柱效远高于高效液相色谱，理论塔板数高达几十万块/米，

19、特殊柱子可以达到数百万。2.消耗低 CE所需样品为nl级, 流动相用量也只需几毫升, 而HPLC所需样品为l级, 流动相则需几百毫升乃至更多。503.速度快一般几十秒至十几分，最多半小时，即可完成一个试样的分析。4.应用广泛 通过改变操作模式和缓冲液的成分，CE有很大的选择性，可以根据不同的分子性质，对极广泛的对象进行有效的分离。 CE分离有机分子、药物分子，特别是手性分子和生物大分子方面的能力，对HPLC地位提出了严峻的挑战。 51三、毛细管电泳的分类按分离模式分类，常用的技术有六种：毛细管区带电泳，胶束电动毛细管色谱，毛细管凝胶电泳，毛细管等电聚焦，毛细管等速电泳 ，毛细管电色谱 毛细管区

20、带电泳是CE中最基本、应用最普遍的一种模式。52四、电渗和电渗流1电渗现象 当固体与液体相接触时，如果固体表面因某种原因带一种电荷，则因静电引力使其周围液体带相反电荷，当液体两端施加一定电压时，就会发生液体相对于固体表面的移动，这种现象叫做电渗。53 高效毛细管电泳大多使用石英毛细管，在内充缓冲液PH2时，管壁的硅醇基（SiOH）离解成硅醇基阴离子（SiO），使管壁带负电荷，溶液带正电荷，在管壁和溶液之间形成双电层。Zeta电位54 由于溶液中的阳离子实际上是溶剂化的，在外电场的作用下，溶剂化的阳离子向负极移动，将引起柱中的溶液整体向负极移动，这就是毛细管电泳中的电渗现象。2。电渗流（elec

21、troosmotic flow，EOF） 电渗现象中整体移动着的液体叫电渗流。553. 电渗流的大小和方向电渗流的大小用电渗流速度vos表示，其大小决定于电渗淌度os和电场强度E。即 、分别是电泳介质的介电常数和粘度, 毛细管壁的Zeta电位，它近似等于扩散层与紧密层界面上的电位。该界面内净电荷数（正电荷数）越多、扩散层越厚，Zeta电位越大.56 Lef毛细管有效长度； tos电渗流标记物（中性物质）的迁移时间。电渗流的速度是电泳速度的57倍。 一般情况下，石英毛细管内壁表面带负电荷，则电渗流带正电荷，向负极移动。但如果将毛细管内壁改性，比如在在内壁表面涂渍或键合一层阳离子表面活性剂，将使壁

22、表面带正电荷，则电渗流带负电荷，向正极移动。VOS可通过实验测定57 在外电场驱动下产生的电渗流为平流，即塞式流形。液体流动速度除在管壁附近因摩擦力迅速减小到零以外，其余部分几乎处处相等。这一点和HPLC中靠泵驱动的流动相的流形完全不同。4.电渗流的流形58 HPLC流动相的流形为抛物线形的层流，在管壁处的速度为零，管中心的速度是平均速度的2倍，引起的谱峰展宽较大。电渗流呈平流，引起的谱峰展宽很小，是毛细管电泳能获得较HPLC更高分离效率的重要原因。4. 电渗流的作用 电渗流通常流向负极，电渗流速度约等于一般离子电泳速度的57倍。所以，各种电性物质在毛细管中的迁移速度为两种速度的矢量和，称为表

23、观电泳速度，用vap表示。5960 当把试样从阳极端注入到毛细管内时，不同电性的粒子将按不同的速度向负极迁移，从负极端先后流出毛细管。出峰次序是： 阳离子中性分子阴离子中性分子与电渗流速度相同，不能互相分离。v=E=(电渗流ep)E61+ =电渗流 + +ep 阳离子运动方向与电渗流一致； - =电渗流 - -ep 阴离子运动方向与电渗流相反； 0 =电渗流 中性粒子运动方向与电渗流一致；电渗流具有像HPLC中泵一样的作用，推动离子前进，加上不同离子电泳速度和方向的差异，完成阳离子、阴离子和中性离子的分离。改变电渗流的大小和方向，可以改变分离效率和选择性。这是HPCE中优化分离的重要因素。电渗

24、流在HPCE 的分离中起着极其重要的作用：电渗流的微小变化影响分离结果的重现性（迁移时间和峰面积） 。电泳中影响电渗流的因素很多，应设法控制电渗流的恒定。62三、HPCE中影响电渗流的因素1.电场强度的影响 电渗流速度和电场强度成正比，当毛细管长度一定时，电渗流速度正比于工作电压。2.毛细管材料的影响 酸度影响毛细管的表面Si-OH基的电离，特别是在pH47范围内，影响更显著，此时溶液pH值与EOF成近线性关系 633. 电解质溶液性质的影响（1）溶液pH的影响 对于石英毛细管，溶液pH增高时，表面电离多，电荷密度增加，管壁zeta电势增大，电渗流增大，pH=7，达到最大； pH3，完全被氢离

25、子中和，表面电中性，电渗流为零。分析时，采用缓冲溶液来保持pH稳定。（2）缓冲液阴离子的影响 在其他条件相同，浓度相同而阴离子不同时，毛细管中的电流有较大差别，产生的焦耳热不同。 64缓冲溶液离子强度，影响双电层的厚度、溶液粘度和工作电流，明显影响电渗流大小。缓冲溶液浓度增加，离子强度增加，电渗流下降。（3）缓冲液浓度（离子强度）的影响65664. 温度的影响 毛细管内温度的升高，使溶液的粘度下降，电渗流增大。 温度变化来自于“焦耳热” 焦耳热：毛细管溶液中有电流通过时，产生的热量； HPCE中的焦耳热与背景电解质的摩尔电导、浓度及电场强度成正比。 温度每变化1度，将引起背景电解质溶液粘度变化

26、2%3%；675. 添加剂的影响（1）加入浓度较大的中性盐，如K2SO4，溶液离子强度增大，电渗流减小。（2）加入表面活性剂，可改变电渗流的大小和方向 某些阳离子表面活性剂使电渗流减小，某些阴离子表面活性剂，如十二烷基硫酸钠（SDS），可以使壁表面负电荷增加，电渗流增大（3）加入有机溶剂如甲醇、乙腈，使溶液的粘度减小，电渗流增大。68第三节 毛细管电泳仪 毛细管电泳仪结构比高效液相色谱仪 简单。CE只需高压直流电源、进样装置、毛细管和检测器等。前三个部件均易实现, 困难之处在于检测器。6970HPCE仪器流程与主要部件 process and main assembly 电压：030kV； 分

27、离柱不涂敷任何固定液； 紫外或激光诱导荧光检测器；（可检测到：10-1910-21 mol/L）2022/10/121.高压电源（1）030 kV 稳定、连续可调的直流电源；（2）具有恒压、恒流、恒功率输出；（3）电场强度程序控制系统；（4）电压稳定性：0.1%；（5）电源极性易转换；2. 毛细管柱 （1）材料：石英 （2）规格：内径2075m，外径350400m；长度电泳,阴离子在负极最后流出。CZE是最基本、应用最广的分离模式7576774.2、胶束电动毛细管色谱（MECC或MEKC） 胶束电动毛细管色谱是在缓冲溶液中加入浓度高于胶束临界浓度的表面活性剂，胶束相在分离中起到了准固定相的作用

28、，是电泳技术与色谱技术的结合。 把离子型表面活性剂 (如十二烷基硫酸钠)加到缓冲液中, 当其浓度超过临界浓度后就形成有一疏水内核、外部带负电的胶束。虽然胶束带负电, 但电渗流的速度仍大于胶束的迁移速度, 故胶束将慢速向负极移动。（一）分离原理 7879 中性粒子按其疏水性不同，在缓冲溶液（流动相）和胶束（准固定相）之间分配。疏水性强、亲水性弱的粒子分配到胶束中的多，分配到缓冲溶液中的少；反之，亲水性强、疏水性弱的溶质分配到胶束中的少，分配到缓冲溶液中的多。当溶质进入胶束时，以胶束的速度慢速迁移；溶质进入缓冲溶液时，以电渗的速度快速前移。分配系数越大的粒子，在柱中迁移速度慢，从而使疏水性稍有差别的中性物质在电泳中得以分离。80 MECC的突出优点是除