PCR实验室(相关资料)

1、PCR：即聚合酶链式反映(Polymerase Chain Reaction)，利用 NA 在体外 95时解旋（变性），55时引物与单链按碱基互补配关于的原则接合（退火），72右，NA(5-3)的方向合成互补链（延伸）。PCR温控设备95，55，72之间很好地进行温度控制。NAPCR 仪分为：普通PCR 仪，梯度PCR 仪，原PCRPCR普通 PCR 仪：一般把一次 PCR 扩增只能运行一个特定退火温度的PCR 仪，称之为普通 PCR 仪，也就是传统的PCR 仪。如果要用它做不同的退火温度则需要多次运行。普通 PCR 仪主要应用于科研、教学、临床医学、试验、检疫等。如:启步 BSW-2P,BS

2、W-3P,ABI 2720 型梯度 PCR 仪：PCR 反映能否成功，退火温度是关键，梯度PCR 仪每个孔的温度可以在指定围依照梯度设置，根PCR（12）PCR不同的 NA 片段其最适合的退火温度不同，经过设置一系列的梯度退火温度进行扩增，从而一次性 PCR 扩增就可以筛选出表达量高的最适合退火温度进行有效的扩增。梯度 PCR 仪主要用于研究未知 NA 退火温度的扩增，这样既节约时间，也节约成本。在不设置梯度的情况下亦可当做普通的 PCR 用。梯度 PCR 仪多应用于分子生物学、医学、食品工业、司法科学、生物技术、环境科学、微生物学、临床诊断、流行病学、遗传学、基因芯片、基因检测、基因克隆、基

3、因表达等领域以聚合酶链式反映（Picymerase Chain Reaction , PCR）为特征的、以检测 NA/RNA 为目的的各种病原体检测及基因分析。如:启步 BSW-2T,BSW-3T,ABI 9700,ABI Veriti, Bio-Ra T100 型原位 PCR 仪：PCR 是提取细胞或组织中的 NA 进行基因扩增反映，而原位 PCR 是保持细胞或组织的完整性， 使 PCR 反映体系渗透到组织和细胞中，在细胞的靶NA 所在的位置上进行基因扩增。不但可以检测到靶 NA，而且还可以了解靶 NA 存在于何种细胞中，更有利于探讨靶NA 与细胞之间的关系。原位 PCR 仪主要应用于：（1

4、）检测外源性基因片段，提高检出率，集中在病毒感染的检查上，如HIV、HPV、HBV、CMV 等；（2）观察病原体在体分布规律；（3）源性基因片段，如人体的单基因病、重组基因、易位的染色体、Ig 的 mRNA 片段、癌基因片段等；（4）检测导入基因；（5）遗传病基因检测如地中海贫血。实时荧光定量 PCR 仪：在普通 PCR的 PCR 仪器。其 PCRPCRPCR 扩增时加入的引物是利用同位素、荧光素等进行标记，使用引物和荧光探针同时与模板特异性接合扩增。扩增的结果经过荧光信号采集系 统实时采集信号连接输送到计算机分析处理系统，得出量化的实时结果输出。荧光定量 PCR有多种荧光标记的时候使用多通道

5、。单通道也可以检测多荧光的标记和目的基因表达产物，因为一次只 能检测一种目的基因的扩增量，需多次扩增才能检测完不同的目的基因片段的量。多通道利于做多重PCR，实现一次检测多种目的基因的功能。荧光定量 PCR个颜色需要一个检测器来检测荧光信号的强弱，每一个针关于不同颜色的检测器，就是一个通道。在使用 有些厂家 5一种荧光染料，ROX 是作为参的，即参照和校正实验结果。在ABI 的机器里显示为红色的水平线。如果你的扩ROX 表明有基因组 NA 污染。）或专用的Reference ye ，这些荧光染PCR 荧光信号的有效通道只有 4PCR 的检测通道是只为自已厂家的专用的荧光染料或试剂开放的，有效检

6、测通道也绝非像宣传资料中宣称的那么多。选择单通道实验还是多通道实验？PCR为零。因此一般两通道的实验比较多些，即一个基因进行多样本比较，用看家基因进行关于照。硬件设计：传统的 96 孔板的荧光定量 PCR 可以容纳的样本量大，而且无需特殊的耗材。有些传统的96CC 检测 ，这些光学结构在 96 孔板的顶部，每个样本孔距光源和检验进程常会使用 ROX（一种荧光染料）或专用的 Reference ye 作为参照校正实验结果。卤钨灯的使用寿命短、更换成本较高已经成为很多用户头痛的问题。在实验进程中卤钨灯作为一种热光源，产生较 多CCBio-ra 公司生产的荧光定量 PCR 就属于这一种。创新的离心式

7、的仪器通常选用 LE 激发、PMT 检测，离心式的设计上避免了边缘效应。LE 光源是冷光源关于实验没有影响，因此无需采用其他荧光染料校正仪器，而且使用寿命长无需经常更换。PMT 每次只能收集单个荧光信号，但是检测灵敏度高。但这类仪器运行速度非常快，但也存在样本量小、耗 材昂贵、没有梯度功能、存在时间积分等缺陷。Corbett 的 Rotor-gene 系列和 Roche 的 Lightcycler 系列均为这一类仪器。在荧光定量 PCR 仪的众多技术参数中，升降温速度也是厂家喜欢大举宣传的指标。更快的升降温， 可以缩短反映进行的时间，而且缩短了可能的非特异性接合、反映的时间，提高PCR 的特异

8、性。PCR 实验室部分区图图 1试剂储存区图 2标本制备区图 3扩增区图 4产物分析区一、PCR 实验室布局PCR 实验室原则上为试剂准备区、样本制备区、扩增区和扩增产物分析区四个单独的工作区域不同功能的工作区应是分隔独力的，各工作区有鲜明的标志，不能直通，如果紧密相连，需安装物品传递窗。前两区为扩增前区，后两区为扩增后区，扩增前区与扩增后区应严格分开。实验材料、试剂、记录纸、笔、清洁材料等，只能从扩增前区流向扩增后区，即从试剂准备区样本制备区扩增区扩增产物分析区，不得逆向流动。实验室的气流也应从扩增前区流向扩增后区，不得逆向流动。各工作区顶部应安装紫外灯，紫外灯的波长为254nm，每 20

9、PCR 实验室原则上为试剂准备区、样本制备区、扩增区和扩增产物分析区四个单独的工作区域不同功能的工作区应是分隔独力的，各工作区有鲜明的标志，不能直通，如果紧密相连，需安装物品传递窗。前两区为扩增前区，后两区为扩增后区，扩增前区与扩增后区应严格分开。实验材料、试剂、记录纸、笔、清洁材料等，只能从扩增前区流向扩增后区，即从试剂准备区样本制备区扩增区扩增产物分析区，不得逆向流动。实验室的气流也应从扩增前区流向扩增后区，不得逆向流动。各工作区顶部应安装紫外灯，紫外灯的波长为254nm，每 20 一支 40W 的紫外灯。二、PCR 实验室各区功能及主要设备1、试剂准备区：主要进行试剂的制备、分装和主反映

10、混合液的制备。试剂和用于样本制作的材料应直接运送至该区，不得经过其它区域。1、试剂准备区：主要进行试剂的制备、分装和主反映混合液的制备。试剂和用于样本制作的材料应直接运送至该区，不得经过其它区域。试剂原材料必需贮存在本区，并且在本区制备成所需的试剂。试剂原材料必需贮存在本区，并且在本区制备成所需的试剂。2、样本制备区：主要进行样本的保存、核酸(RNA、NA)提取、贮存及其加入至扩增反映管和测定NA 的合成。本区主要设备有冰箱、生物安全柜、离心机、加样器、振荡器、恒温水浴等。本区的压力梯度要求为：相关于于邻近区域为正压，以避免从邻近区进入本区的气溶胶污染。NA 的合成。本区主要设备有冰箱、生物安

11、全柜、离心机、加样器、振荡器、恒温水浴等。本区的压力梯度要求为：相关于于邻近区域为正压，以避免从邻近区进入本区的气溶胶污染。3、扩增区：主要进行NA 扩增。此外，已制备的NA 模板 (来自样本制备区)的加入和主反映混合液(来自试剂准备区)制备成反映混合液等也可在本区进行。本区主要设备有：扩增仪、冰箱、离心机、加样器等。本区的压力梯度要求为：相关于于邻近区域为负压，以避免气溶胶从本区漏出。合液(来自试剂准备区)制备成反映混合液等也可在本区进行。本区主要设备有：扩增仪、冰箱、离心机、加样器等。本区的压力梯度要求为：相关于于邻近区域为负压，以避免气溶胶从本区漏出。4、扩增产物分析区：扩增产物的测定。

12、本区主要设备有酶标仪、洗板机、加样器和水浴箱等。本区的压力梯度的要求为：相关于于邻近区域为负压，以避免扩增产物从本区扩散至其它区域。本区主要设备有酶标仪、洗板机、加样器和水浴箱等。本区的压力梯度的要求为：相关于于邻近区域为负压，以避免扩增产物从本区扩散至其它区域。三、PCR 实验室通风系统及压力控制各区域之间应具备单向的实验工艺流、物流、人流与气流，形成单向流程的保护屏障，避免实验之间的相互干扰，防止气溶胶扩散关于实验进程造成污染。PCR 实验室并且没有严格的净化要求，但是为避免各个实验区域交叉污染的可能性，宜采用全送各区域之间应具备单向的实验工艺流、物流、人流与气流，形成单向流程的保护屏障，

13、避免实验之间的相互干扰，防止气溶胶扩散关于实验进程造成污染。PCR 实验室并且没有严格的净化要求，但是为避免各个实验区域交叉污染的可能性，宜采用全送四、PCR 实验室装饰实验室围护结构应牢固、气密性好；一切阴阳角宜采用圆弧过渡；墙体壁光洁、不积尘、耐腐蚀、易清洗消毒；地面使用PVC 卷材或环氧树脂自流坪，材料应满足无缝隙、无渗漏、光洁、耐腐蚀的要求。实验室围护结构应牢固、气密性好；一切阴阳角宜采用圆弧过渡；墙体壁光洁、不积尘、耐腐蚀、易清洗消毒；地面使用PVC 卷材或环氧树脂自流坪，材料应满足无缝隙、无渗漏、光洁、耐腐蚀的要求。五、PCR 实验室注意事项1、几个区域的大小设置情况，试剂准备区、

14、扩增区、扩增产物分析区，空间可以相关于小一些，样品制备区要放置生物安全柜和低温冰箱，空间应大一些。2、试剂准备区、样本制备区设紧急洗眼器，以保证操作人员的安全。3、PCR 实验室没有严格的净化要求，可以根据用户的使用情况和资金的投入选择。1、几个区域的大小设置情况，试剂准备区、扩增区、扩增产物分析区，空间可以相关于小一些，样品制备区要放置生物安全柜和低温冰箱，空间应大一些。2、试剂准备区、样本制备区设紧急洗眼器，以保证操作人员的安全。3、PCR 实验室没有严格的净化要求，可以根据用户的使用情况和资金的投入选择。病理科病理诊断试剂及配套设备全系列的产品，涵盖了液基细胞学、免疫组织化学和分子基因诊

15、断。病理诊断试剂及配套设备全系列的产品，涵盖了液基细胞学、免疫组织化学和分子基因诊断。产品囊括液基细胞学系列产品、荧光原位杂交技术、荧光定量PCR 技术、一代测序技术、液相基因产品囊括液基细胞学系列产品、荧光原位杂交技术、荧光定量PCR 技术、一代测序技术、液相基因沉降式全自动制片染色系统：根据人体不同类型细胞其比重不同的特点，尤其是病变细胞比重大、沉降速度快，与特殊处理后的载玻片相互吸引，从而最大程度地捕捉病变细胞和具有诊断价值的成分，自动湿染色，最终制成背景清晰、诊断线索明确的单层细胞薄片。全自动沉降式制片染色系统每批次可以处理 1-24 个标本，每天 7 小时可以处理 300 制片，单片

16、独力滴染，染液一次性使用，避免样本交叉污染。沉降式全自动液基细胞学制片染色系统广泛应用于宫颈癌筛查，同时诊断痰细沉降式全自动制片染色系统：根据人体不同类型细胞其比重不同的特点，尤其是病变细胞比重大、沉降速度快，与特殊处理后的载玻片相互吸引，从而最大程度地捕捉病变细胞和具有诊断价值的成分，自动湿染色，最终制成背景清晰、诊断线索明确的单层细胞薄片。全自动沉降式制片染色系统每批次可以处理 1-24 个标本，每天 7 小时可以处理 300 制片，单片独力滴染，染液一次性使用，避免样本交叉污染。沉降式全自动液基细胞学制片染色系统广泛应用于宫颈癌筛查，同时诊断痰细荧光原位杂交（FISH）：FISH荧光标记

17、的核酸探针，经过变性退火，和样本中碱基互补序列特异性接合成NA 双链，然后经过荧光显微镜检测分析。由于 FISH遗传学、基因相关疾病的分型和肿瘤个体化治疗等领域。液相芯片技术是以 100：将预先人工合成的寡核苷酸探针共价连接于微球表面构成。液相基因芯片除具有一般固 析特征。液相蛋白芯片：临床检测囊括：1 抗原抗体定量定性检测；2 细胞因子检测。测序技术测序技术第一代Sanger 链终止法一代测序技术是 20 世纪 70 年代中期由 Fre Sanger 及其同事首先发明。其基本原理是，聚丙烯酰胺凝胶电泳能够把长度只差一个核苷酸的单链NA 分子区分开来。一代测序实验的起始材料是均一的单链NA 分

18、子。第一步是短寡聚核苷酸在每个分子的相第一代Sanger 链终止法一代测序技术是 20 世纪 70 年代中期由 Fre Sanger 及其同事首先发明。其基本原理是，聚丙烯酰胺凝胶电泳能够把长度只差一个核苷酸的单链NA 分子区分开来。一代测序实验的起始材料是均一的单链NA 分子。第一步是短寡聚核苷酸在每个分子的相同位置上退火，然后该寡聚核苷酸就充当引物来合成与模板互补的新的NA 链。用双脱氧核苷酸作为链终止试剂（双脱氧核苷酸在脱氧核糖上没有聚合酶延伸链所需要的3OH 基团，所以可被用作链终止试剂）经过聚合酶的引物延伸产生一系列大小不同的分子后再进行分离的方法。测序引物与单链 NA 模板分子接合

19、后，NA 聚合酶用 NTP 延伸引物。延伸反映分四组进行，每一组诀别用四种NTP（双脱氧核苷酸）中的一种来进行终止， 再用 PAGE 分析四组样本。从得到的 PAGE 胶上可以读出我们需要的序列。第二代大规模平行测序大规模平行测序平台（massively parallel NA sequencing 的出现不仅令NA能够被众多研究人员分享。新一代NA 测序技术有助于人们以更低廉的价格，更全面、更深入地分析基因组、转录组及蛋白质之间交互作用组的各项数据。市面上出现了很多新一代测序仪产品，例如美国Roche Applie Science 公司的 454 基因Illumina 公司和英国 Solex

20、a technologyIlluminaApplie BiosystemsSOLiIllumina/Solexa Genome Analyzer 测序的基本原理是边合成边测序。在Sanger 等测序方法的基础上，经过技术创新，用不同颜色的荧光标记四种不同的NTP，当 NA 聚合酶合成互补链时，每添加一种 NTP 就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并且经过特定的计算机软件处理，从而获得待测 NA 的序列信息。以 Illumina 测序仪说明二代测序的一般流程，（1）文库制备，将 NA 用雾化或超声波随机片段化成几百碱基或更短的小片段。用聚合酶和外切核酸酶把 NA 片段切成平末端，紧接着磷以

21、 Illumina 测序仪说明二代测序的一般流程，（1）文库制备，将 NA 用雾化或超声波随机片段化成几百碱基或更短的小片段。用聚合酶和外切核酸酶把 NA 片段切成平末端，紧接着磷酸化并且增加一个核苷酸黏性末端。然后将Illumina 测序接头与片段连接。（2）簇的创建，将模酸化并且增加一个核苷酸黏性末端。然后将Illumina 测序接头与片段连接。（2）簇的创建，将模板分子加入芯片用于产生克隆簇和测序循环。芯片有8 个纵向泳道的硅基片。每个泳道芯片表面有无数的被固定的单头。上述步骤得到的带接头的NA 片段变性成单链后与测序通道上的接头引物接合形成桥状结构，以供后续的预扩增使用。经过不断循环获

22、得上百万条成簇分布的双链待测片段。（3）测序，分三步：NA 聚合酶接合荧光可逆终止子，荧光标记簇成像，在下一个循环开始前将接合的核苷酸剪切并且分解。（4）数据分析。-第三代高通量、单分子测序被称为第三代的测序的s板分子加入芯片用于产生克隆簇和测序循环。芯片有8 个纵向泳道的硅基片。每个泳道芯片表面有无数的被固定的单头。上述步骤得到的带接头的NA 片段变性成单链后与测序通道上的接头引物接合形成桥状结构，以供后续的预扩增使用。经过不断循环获得上百万条成簇分布的双链待测片段。（3）测序，分三步：NA 聚合酶接合荧光可逆终止子，荧光标记簇成像，在下一个循环开始前将接合的核苷酸剪切并且分解。（4）数据分

23、析。-第三代高通量、单分子测序被称为第三代的测序的se的T技术和Nanopore Technologies 公司正在研究的纳米孔单分子测序技术正向着高通量、低成本、长读取长度的方向发展。不同于第二代测序依赖于 NA 模板与固体表面相接合然后边合成边测序，第三代分子测序，不需要进行 PCR 扩增。（1）Helico BioScience 单分子测序技术。该测序是鉴于边合成边测序的思想，将待测序列随机打断成小分子片段并且用末端转移酶在 3 末端加上 poly(A),以及在 poly(A)的末端进行荧光标记和阻断，把这些小片段与带有poly(T)的平板杂交成像来获得已经杂交模板所处的位置，建立边合成

24、边测序的位点 加入聚合酶和被 Cy3 荧光标记脱氧核苷酸进行 NA 合成，每次只加入一种脱氧核苷酸，然后将未参与合成的 NTP 和 NA 聚合酶洗脱，直接关于 Cy3 成像，观测模板位点上是否有荧光信号，然后化学裂解核苷酸上的燃料并且释放加入下一种脱氧核苷酸和聚合酶的混合物，进行下一轮反映。（2）Pacific（2）Pacific BioscienceSMRTT 技术。该测序也是鉴于边合成边测序的原理，这项技于使用了 Zero-MoeWaveguie(ZMW)(零级波导)。测序的进程：被荧光标记磷酸集团的核苷酸在聚合酶活性位点上与模板链接合（每种脱氧核苷酸被不用颜色的染料标记），被激发出荧光，

25、在荧光脉冲结束后，被标记的磷酸集团被切割并且释放，聚合酶转移到下一个位置，下一个脱氧核苷酸连接到位点上开始释放荧光脉冲，进行下一个循环。用了 Zero-MoeWaveguie(ZMW)(零级波导)。测序的进程：被荧光标记磷酸集团的核苷酸在聚合酶活性位点上与模板链接合（每种脱氧核苷酸被不用颜色的染料标记），被激发出荧光，在荧光脉冲结束后，被标记的磷酸集团被切割并且释放，聚合酶转移到下一个位置，下一个脱氧核苷酸连接到位点上开始释放荧光脉冲，进行下一个循环。 Nanopore Technologies 的纳米孔单分子测序技术。大多数纳米孔测序技术的基本原理是当 NA 分子或者它的组成碱基从一个孔洞经过时而检测到被影响的电流或光信号。OxforNanopore 测序技术是以- 溶血素来构建生物纳米孔，核酸外切酶依附在孔一侧的外表面，一种合成的环糊精做为传感器共价接合到纳米孔的表面。这个系统被镶嵌在一个脂双分子层，为了提供既契合碱基区分检测又满足外切酶活性的物理条件，脂双分子层两侧为不同的盐浓度 在适合的电压下，核酸外切酶消化单链 NA，单个碱基落入孔中，并且与孔的环糊精短暂的相互作用，影响了流过纳米孔原本的电流，腺嘌呤与胸腺嘧啶的