对流免疫电泳课件

1、对流免疫电泳武汉大学基础医学院免疫学教研室熊 洁实 验 原 理 对流免疫电泳是双向琼脂扩散与电泳技术的结合。Ag或Ab分子在一定的pH溶液中带有电荷，在电场作用下可发生定向移动。将Ag、Ab分别加在pH为8.6缓冲液琼脂中电泳，因各种血清蛋白质都带负电荷，泳向阳极。由于电渗作用，液体则流向阴极，二者方向相反。 Ab带负电荷少，分子量大，所以电泳力小于电渗力，向阴极移动。而Ag所带负电荷多，分子量较小，故其电泳力大于电渗力，向正极移动。 如Ag、Ab相应，相遇，在比例适当时即形成白色沉淀线。由于电场限制了AgAb分子的自由扩散，因而提高了试验的敏感性(提高1020倍)，并缩短了反应时间（与双向琼

2、脂扩散相比）。同双扩，可定性确定抗原含量。 材 料抗原：待测人血清抗体：抗人血清巴比妥缓冲液（0.05 mol/L, Ph 8.6）、1.5%巴比妥缓冲离子琼脂其他：电泳仪、琼脂板打孔器、载玻片、毛细吸管、电表方 法制板：取4 ml 煮沸的1. 5 巴比妥琼脂，立即浇注在玻片上，制成厚薄均匀的琼脂板打孔：待琼脂凝固后，用打孔器按下图打孔，孔径3 mm，孔距5 mm。电泳：琼脂板放入电泳槽内，琼脂板两端用滤纸或纱布与缓冲液相接，Ag端接负极电源，Ab端接正极电源。按电场强度46 V/cm电泳50 min左右。电泳完毕，关闭电源，取出琼脂板，在黑色背景下观察，凡AgAb孔间出现白色沉淀线者为阳性，

3、孔间无白色沉淀线者为阴性。如沉淀线不清晰可将琼脂板置37温箱数小时后再进行观察，也可染色观察。在Ag与Ab孔间出现沉淀线者为阳性。沉淀线形状、位置等差异，与Ag、Ab浓度及分子量有关。 抗原-抗体反应包括凝集反应、沉淀反应、补体结合反应和中和反应等。 抗原-抗体反应可用已知的特异性抗体检测未知的抗原；也可用已知的抗原检测未知的抗体。 免疫荧光技术、免疫酶技术、同位素标记技术、发光免疫分析等免疫标记技术提高了抗原抗体反应的敏感性。 抗原-抗体反应的特点:1. 特异性：抗原-抗体的结合是特异性结合2. 可逆性：抗原抗体结合是分子表面的非共价键 结合3. 阶段性：抗原抗体反应可分为两个阶段 特异性结

4、合阶段 可见的反应阶段4. 比例性：抗原和抗体结合是否呈现可见的反应 现象与两者的分子比例密切相关抗原-抗体反应受多种因素影响1 . 电解质：抗原-抗体反应通常应用0.85%的氯化钠 作为稀释液 ，以供给适应浓度的电解质。2 . 温度：一般使用反应在37度水浴或孵育箱中进行。3. 酸碱度：抗原-抗体反应适应的酸碱度为PH68。1、直接凝集玻片凝集：定性实验，已知Ab测未知Ag 用于细菌和血型鉴定 玻片凝集反应是在玻片上将抗体直接与颗粒性抗原物质（如细菌、红细胞等）混合，在有适当电解质存在的条件下，如两者对应便发生特异性结合而形成肉眼可见的凝集物，即为阳性；如两者不对应便无凝集物出现，即为阴性。

5、试管凝集试验：半定量实验 已知Ag定量测Ab 用已知的定量的颗粒性Ag悬液直接与系列稀释的待检血清（Ab）在试管内混合，经一定时间后，观察各管有无凝集，并根据凝集程度定量测定血清中的Ab水平及其效价。2、间接凝集 将可溶性Ag（或Ab）包被在惰性颗粒载体（红细胞、乳胶颗粒等）表面，再与相应Ab（或Ag）反应，出现颗粒物凝集的现象。（二）沉淀反应定义：可溶性Ag（如血清蛋白、细胞裂解液或 组织液等）与相应Ab特异性结合，在一定条件下，出现肉眼可见的沉淀物现象。方法：环状沉淀 絮状沉淀 免疫比浊琼脂凝胶扩散： 单向免疫扩散 双向免疫扩散 对流免疫电泳 火箭电泳 免疫电泳单向免疫扩散原理 将某种特异

6、性Ab混合于琼脂凝胶中，制成含Ab的琼脂板，再于琼脂板上打孔，并将一定量的Ag加入孔中。 Ag在孔中向四周作辐射状扩散，如Ag与已知的Ab相对应，在两者比例适合处出现由免疫复合物所形成的白色沉淀环。 沉淀环直径的大小与Ag的含量成正比。以不同浓度的标准Ag与固定浓度的Ab抗体反应后测得沉淀环的直径作为横坐标，以Ag浓度为纵坐标可绘制标准曲线。根据待测样本沉淀环的大小，从标准曲线中即可推算其含量。主要用于定量测定抗原或IgG、 IgM、 IgA。双向免疫扩散原理 将可溶性Ag和Ab分别加到琼脂板上相应的小孔中，使两者各自向四周扩散，若Ag与Ab相对应，两者相遇即发生特异性结合，并在比例适合处形成白色沉淀线。每一对应Ag和Ab可出现一条沉淀线，根据沉淀线的有无、位置、形状以及对比关系，可分析Ag或Ab成分。 双向扩散示火箭电泳原理 火箭电泳是单向免疫扩散和电泳相结合的一种定量检测Ag的技术。在含已知Ab琼脂中打孔，再加入待测Ag，通电后Ag定向地通过含有Ab的琼脂，相应的Ag和Ab在比例合适处形成沉淀峰。沉淀峰的高度与Ag浓度呈正比。该法可定量检测Ag。免疫电泳原理 免疫电泳是电泳和双向免疫扩散相结合的一种Ag方法。先将