芯片瞬间等速电泳筛分电泳偶联分析精确计算DNA长度

1、芯片瞬间等速电泳-筛分电泳偶联分析准确计算DNA长度【摘要】建立了基于相对迁移时间比例的方法，根据待侧dna片段相对于上位及下位内标的迁移时间比例进展长度预测。实验结果显示，dna片段的相对迁移时间比例在不同分析条件下具有良好的重现性。通过建立相对迁移时间比例相对于dna片段长度的对应关系公式，实现了芯片瞬间等速电泳条件下dna片段长度的准确预测。实际样品分析证实这种基于相对迁移时间比例的计算方法简单可靠，合适于芯片titp-ge分析中dna长度的准确断定。【关键词】芯片电泳；瞬间等速电泳；dna长度计算；迁移时间；样品盐浓度preisepreditinfdexyribnuleiaidsize

2、sithtransientistahphreis-apillarygeleletrphresisanalysisnairhipliuda-yu，liangguang-tie，jian-kun，zhuxia-ian(labratryfadvanedlinialheialtehnlgy，guangzhufirstuniipalpepleshspital，affiliatedhspitalfguangzhuedialllege，guangzhu510180)(departentflabratryediine，guangdngn.2prvinialpepleshspital，guangzhu51031

3、7)abstrattheigratin-tieintransientistahphresis(titp)hisrk，adnasizingethdthatbasednrelativeigratin-tieprprtin(rp)asdevelpedteliinat

4、etheeffetfsaplesalinitynsizingpreisin.rpasdefinedastheratiftheigratin-tiedifferenebeteenthetargetfragentandthelerarkertthatbeteentheupperarkerandthelerarker.therpvalueseretestedtbereprduibleinirhiptitp-geseparatinsirrespetivefsaplesalinity.sizefatargetdnaaspreditedbyfittingitsrpvaluettheequatinderiv

5、edfrrpsfstandarddnaladdervs.dnasizes.thepreisinandreprduibilityfthesizingethderevalidatedtestingultiplestandardpraplins.experientalresultsshedthattherpethdissipleandreliable，thusellsuitedtpreisednasizingithirhiptitp-geanalysis.keyrdsirhipeletrphresis；transientistahphresis；dexyribnuleiaidsizing；igrat

6、intie；saplesalinity1引言芯片电泳具有快速高效分析、低消耗和便于实现各种操作单元灵敏组合及规模集成的特点1，2。上述特点和优势使得芯片电泳成为一种极具开展潜力的生物分析技术。dna分析是芯片电泳最为成功的应用领域之一，多种类型dna样品在芯片平台实现了高效分析35。芯片电泳由于采用微尺寸通道便于实现高效别离，但同时由于通道尺寸造成的进样量限制也影响了检测灵敏度。为改善芯片电泳检测灵敏度，近期研究开展了多种在线预浓缩方法并获得显著效果6。等速电泳是在芯片dna分析中应用较为普遍的在线预浓缩技术79，该技术可显著改善检测灵敏度而不损失别离效率。瞬间等速电泳(transientis

7、tahphresis，titp)是一种简化的等速电泳预浓缩方式，利用样品基质sapleatrix中的离子为前导或尾随离子，将等速电泳预浓缩与后续的区带电泳别离偶联10。在芯片上偶联瞬间等速电泳和筛分电泳titp-ge，可以简单有效地改善高盐dna样品的检测灵敏度11，12。dna定性分析通常是通过比拟待测样品与标准样品的迁移时间来确定dna片段大小，因此不同样品迁移时间的一致性对于长度断定的准确性具有重要影响。在titp-ge分析中，由于等速电泳持续时间受样品区带电导率影响，样品盐浓度影响瞬间等速电泳持续时间以及整体迁移时间13，14。不同盐分样品之间的迁移时间差异不利于准确定性分析。针对这个

8、问题，曾有研究报道通过引入内标校正titp分析中由于样品盐分不同引起的迁移时间变异14。本研究中，为了消除样品盐浓度对于dna长度断定的影响，在芯片titp-gedna分析中引入内标。待侧dna片段相对于双内标的迁移时间比例，即相对迁移时间比例relativeigratin-tieprprtin，rp，用于dna长度计算。研究结果显示，本方法以下简称rp法简单可靠，合适于芯片titp-ge分析中dna长度的准确断定。2实验局部2.1仪器与试剂芯片电泳实验在自行研制的激光诱导荧光微流控芯片电泳分析仪11上完成。该仪器由芯片电泳平台、光学检测系统、d监测、高压电源控制和操作软件组成，检测方式为共聚

9、焦激光诱导荧光。仪器分析软件可以设定电泳分析各步骤中电极输出状态，显示电泳谱图以及迁移时间、峰高、峰面积和半峰宽等参数。咪唑、n-(乙-羟乙基哌嗪-n-2乙烷磺酸(hepes，siga公司)；羟丙甲基纤维素hp，2，粘度为4060p，aldrih公司)；系列标准dna片段，100bpdnaladder(100600bp，tiangen公司；50bpdnaladder(501500bp，takara公司；插入式dna标记染料genefindertbivisin公司。2.2实验方法2.2.1芯片设计和制作玻璃基板6.56.5，长沙韶光铬版外表涂有正光刻胶。玻璃芯片采用标准光刻-湿法腐蚀-热封接方法

10、加工而成5。芯片通道为双t构造，有效样品区带长度7.5。芯片通道深度30，通道半高宽50。芯片电泳有效别离通道长度为4，参考文献16的方法对通道外表进展线性丙烯酰铵涂层以抑制电渗流和外表吸附。2.2.2芯片电泳芯片电泳实验中使用运行缓冲液含20l/lhepes-40l/l咪唑、1genefinder以及不同浓度的hp筛分介质；缓冲液ph=7.5。缓冲液使用双蒸水配制，使用前过滤。芯片在titp-ge分析中，缓冲液b首先加在b，然后是b和s图1。在s储液池使用真空泵连续施加负压，所有通道充满筛分介质。图1芯片电泳titp-ge分析示意图略fig.1illustratinftransientist

11、ahphresis(titp-ge)analysisnairhipiththeduble-tsapleinjetrunit含前导电介质样品sapleinie；前导离子leadingins；含背景电介质筛分介质bgeinsievingatrix；样品saple；s.样品废液sapleaste；b.缓冲液buffer；b.缓冲液废液bufferaste。最后，样品加于s储液池。电分析程序包括两步：进样过程在s和s之间施加300v/场强，s接地，持续30s；别离过程在b和b之间施加别离场强，b接地，持续300s。3结果与讨论3.1titp-ge偶联芯片电泳别离机制dna样品通常含有较高盐分，电进样时

12、由于样品盐浓度对于进样量的影响17，进样量受到抑制因此影响检测灵敏度。titp-ge分析可以通过进样量的增加进步信号强度，合适于改善芯片电泳分析的检测灵敏度。本实验中的titp预浓缩选择hepes为尾随离子，l-为前导离子，dna的迁移速度介于hepes和l-之间。dna样品通常含有较高l-浓度，可直接用作前导离子而不必额外使用前导缓冲液。如图1所示，titp-ge分析都包含进样、titp预浓缩与ge别离3个过程。与十字架构造芯片通道相比，本实验使用的双t构造进样通道允许更大的进样量。施加别离电压后，l-由于迁移速度快而迅速形成前导区带，这样l-，dna和hepes根据迁移速率形成连续区带，电

13、导率从前导区带到尾随区带依次降低。由于电导率的差异，位于前导区带后的样品区带分担较高场强。因此，dna样品区带被压缩成狭窄样品塞。由于不同长度dna片段在筛分介质中迁移速度不同，每个片段的titp预浓缩是依次完成的。随着别离时间的延长，前导离子浓度因扩散而逐渐降低。当前导离子浓度降低到一定程度，itp状态不可以继续维系而转为ge。由于样品区带各个组分在titp过程被压缩为狭窄样品塞，后续ge的别离度不会因为进样量增加而损失。因此，titp和ge偶联别离方式可以简便有效地改善检测灵敏度。使用这种芯片titp-ge分析方法，dna预浓缩/别离操作得以简化，整个分析过程仅需1种运行缓冲液和4个电极就

14、可以完成。3.2样品盐浓度对titp-ge别离迁移时间的影响dna的titp预浓缩效果受样品中盐浓度影响。一方面，根据khlraush调节公式khlraushregulatingfuntin，krf18，等速电泳压缩区带中样品浓度取决于前导离子浓度；另一方面，titp预浓缩效果还受等速电泳持续时间影响，而后者与样品盐浓度有关3。在titp和ge偶联别离中，ge在titp完毕后开场。假设某一样品组分的迁移时间为t，那么有tttitptge(1)其中，ttitp和tge分别是该样品组分的等速电泳持续时间和筛分电泳从启动至到达检测点的时间。由于titp为样品区带压缩过程，根本没有别离。titp的持续

15、时间影响ge启动时间以及样品各个组分的迁移时间。在样品基质中含有前导离子条件下，样品i的ttitp维持时间计算公式13为ttitp=lssi-i2(2)其中，ls和s分别为样品区带长度和其电导率，i是电流，i和t分别为前导离子、样品和尾随离子的迁移速率，it。根据公式(2)可知，在给定条件下包括分析样品、背景缓冲液成分、别离场强和样品区带长度，titp维持时间与样品区带电导率成正比。电导率s的计算公式为s=fiziui(3)其中f是法拉第常数，i是某种离子浓度，zi是离子的电荷数，ui是离子迁移率。从公式2和式(3)可知，瞬间等速电泳维持时间与样品的盐浓度有关。高盐样品因为电导率高，titp维

16、持时间较长并相应地导致ge启动延迟，反之亦然。不同类型dna样品盐浓度差异很大，会影响电泳迁移时间的一致性而导致dna长度断定偏向。如图2所示，dnaladder的样品基质为te缓冲液10l/ltris-hl，1l/ledta，其盐浓度与pr样品缓冲液(10l/ltris-hl，50l/lkl，2.5l/lgl2)具有较大差异。从分析结果可见，由于样品盐浓度的差异，titp-ge分析中pr产物和具有一样片段长度的dnaarker迁移时间存在明显差异，样品盐分不同导致的迁移时间变化不利于准确断定dna长度。图2芯片titp-ge方法分析pr产物(200bp)和dnaladder(100600bp

17、)的电泳谱图略fig.2irhiptitp-geanalysisf200bpprprdutand100-600bpdnaladdertebuffer：10l/ltris-hl，1l/ledta；prbuffer：10l/ltris-hl，ph8.3，50l/lkl，2.5l/lgl2.3.3基于rp的dna长度计算方法rp法的原理是通过引入相对迁移时间比例这个参数来克制titp-ge分析中存在的迁移时间不重复问题。样品中盐分的差异可以影响迁移时间但不会影响dna片段之间的相对迁移速度，因为dna在一定浓度筛分介质中的相对迁移速度只与片段长度相关。图3描绘了rp法计算dna长度的原理。rp法需要

18、引入上位内标和下位内标，其中下位内标迁移时间低于待分析样品中所有组分，而上位内标迁移时间高于样品中所有组分。假如上位内标与下位内标迁移时间差为t，而某一待测dna片段与下位内标的迁移时间差为t，那么其相对迁移时间比例rp=t/t。根据这种计算方法，样品中dna片段的rp值在01分布之间。通过分析dnaladder，获取一系列标准长度dna片段的rp值。利用拟合方程建立rp值与dna片段长度的对应关系式，待测dna样品同样参加上位内标与下位内标，以获得每个待侧dna片段的rp值。将待侧dna片段的rp值带入公式，即可计算出其片段长度。图3图示说明基于相对迁移时间比例的dna长度计算方法略fig.

19、3illustratinfrelativeigratin-tieprprtin(rp)sizingapprah从表1和图3b可见，含不同盐分的样品中dna的rp值与片段长度都具有良好的相关性。结果显示，在上位内标与下位内标片段长度差较小条件下具有更好的相关性。在16600bp测量范围内，经过三级对数衰减模型拟合expnentialdeaydel，thirdrder，rp值与dna片段长度的相关性可以到达0.999以上；在501500bp范围内，其相关性也到达0.99以上。考察发现，虽然不同dna样品迁移时间差异较大，但其rp值的重复性相当好。上述结果提示，rp法可以准确断定dna长度。表1芯片

20、titp-ge分析中dna片段rp值重复性以及其与dna长度相关性的考察略table1reprduibilityfrpanditsrrelatinithdnasizebytitp-genairhip*a：2%hydrxyprly-ethylellulse(hp)；*b：1.5%hp；*：0.8%hp.tebuffer：10l/ltris-hl，1l/ledta；prbuffer：10l/ltris-hl，50l/lkl，2.5l/lgl2。考察了不同titp-ge分析条件，包括别离场强、筛分介质浓度以及样品盐浓度对于dna长度断定的影响表2。结果显示，较低别离场强不利于进步dna长度断定精度。

21、考虑是因为低场强条件下不利于进步titp预浓缩效率，造成titp持续时间延长以及ge分析中峰拓展等因素影响迁移时间断定。根据实验结果，选择190v/别离场强用于后续分析。由于电进样条件下样品盐分对于进样量的影响，不同盐分dna样品的信号强度存在明显差异图4，但是根据rp值相应长度dna片段都可以对齐。此结果说明，通过rp校正可以消除样品的盐浓度对于迁移时间的影响。在所使用0.82hp筛分介质浓度条件下，都可以获得满意的定性精度。因dna片段在不同浓度筛分介质中的迁移行为存在差异，其在不同筛分介质中的rp值也存在差异。因此，针对某种筛分缓冲液要建立针对性dna片段长度计算公式。上述结果显示，rp

22、法适用于较宽的实验条件范围，此方法可以有效解决样品盐浓度变化对于dna长度断定的影响。表2不同分析条件下rp法dna长度计算精度的考察略table2averageerrr(%)fpreditedsizesunderdifferentseparatinnditins表中数值为10次平行分析的平均值thefiguresareaveragevaluesfr10parallelseparatins。a.0.5prbuffer0.8%hp；b.190v/fieldstrength0.8%；.190v/fieldstrength0.5prbuffer.d.下位内标(ler-arker)50bp，上位内标(

23、upper-arker):1500bp；e.下位内标(ler-arker)：16bp，上位内标(upper-arker):800bp；f.下位内标(ler-arker):16bp，上位内标(upper-arker):600bp。图4不同盐分dna样品的芯片titp-ge分析结果(a)及使用rp法处理后的电泳谱图(b)略fig.4aterfalldeeletrphergrashingdnasaplesfdifferentsalinitythatanalyzedithirhiptitp-ge(a)，andtheeletrphergrasalignedbyrp(b)下位内标ler-arker16bp

24、；上位内标upper-arker：1500bp。系列dna片段碱基对数目thesizesfdnafragent：50，100，150，200，250，300，350，400，450，500，600，700，800，900and1000bp。3.4实际样品分析考察rp方法分别使用16600bp以及501500bp内标对一系列标准pr产物进展了长度计算，以考察rp法长度计算精度。从图5可见，根据rp值，每个pr产物与dnaladder中一样长度dna片段都可以对齐。将pr产物rp值带入计算公式，计算结果显示，16600bp范围内计算偏向为1.32，而501500bp范围内计算偏向为1.04表3。由

25、于分辨力的限制以及碱基构成和二级构造对双链dna迁移速率的影响9，0，双链dna的定性精度低于单链dna。本实验所获得的dna定性精度到达了标准芯片无胶筛分电泳的程度。上述结果证明，rp法可以有效消除因为迁移时间不重复对于dna长度断定精度的影响，合适于titp-ge条件下芯片电泳dna片段长度的准确断定。图5根据rp值将系列标准pr产物分析结果与dnaladder对齐略fig.5eletrphergrasalignedbyrp.analytialdataasfrirhiptitp-geanalysisfstandardprprduts下位内标(ler-arker)：16bp，上位内标(upp

26、er-arker)：600bp。dnaladder样品基质为tebuffer：10l/ltris-hl，1l/ledta；prbuffer：10l/ltris-hl，ph8.3，50l/lkl，2.5l/l，gl2。图中标示数字为dna片段碱基对数目thenubersneletrphergrasrrespndtthesizesfprprdutinbp。表3rp法对标准长度pr产物的长度计算结果略table3preditedsizesfstandardpraplinsithrpethda.别离条件separatinnditins：1.5%hp，190v/；下位内标ler-arker16bp，上位内标upper-arker600bp；b.别离条件separatinnditins：0.8%hp，190v/；下位内标ler-arker50