基因工程主要技术与其原理

1、关于基因工程的主要技术及其原理第1页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四原理琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA的分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带琼脂糖凝胶电泳第2页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高聚物，是由D半乳糖和3、6脱水L半乳糖结合的链状多糖 第3页，共149页，2022年，5月

2、20日，8点15分，星期四猪基因组DNA及PCR产物电泳仪，电泳槽，电子天平，移液器，枪头，微波炉，紫外透射检测仪等。 琼脂糖，1XTAE电泳缓冲液，溴化乙锭（EB），6X载样缓冲液 ： 0.25%溴酚蓝 ，0.25%二甲苯青 ，40%蔗糖水溶液; 0.25%溴酚蓝 ，0.25%二甲苯青 ，30%甘油水溶液实验材料、器具及药品第4页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四相关知识： 影响琼脂糖凝胶DNA迁移速率的因素、迁移速率由DNA的分子大小、琼脂糖浓度、DNA的构象、所加电压、电场方向、碱基组成与温度、嵌入染料的存在、电泳缓冲液的组成等许多参数确定。 表 琼脂糖浓度与DNA

3、分离范围第5页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四实验步骤 1g 琼脂糖加入100ml 1TAE电泳缓冲液中，摇匀。在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解。（冷却到60，加入100l的0.5mg/ml EB，并摇匀。） 用胶带将制胶板两端封好，插入适当梳子，将溶解的琼脂糖（约50）倒入，室温冷却凝固 充分凝固后撕掉两端的胶布，将凝胶置入电泳槽中，加1TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1-2mm，小心垂直向上拔出梳子。第6页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四(4) 用移液器吸取总DNA或质粒样品4l于点样板上，再加入上样缓冲液loading buffer，混匀后，小

4、心加入点样孔。 打开电源开关，调节电压至3-5V/cm，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，电泳约30min-60min。 将凝胶放入EB染液中染色5-10min,用清水稍微漂洗。 将染色后的凝胶置于紫外透射检测仪上，盖上防护观察罩，打开紫外灯，可见到发出荧光的DNA条带。实验步骤第7页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四结果与分析 图2 基因组DNA1%琼脂凝胶电泳图第8页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四结果与分析 图2 PCR产物琼脂凝胶电泳图 (1、2、3、4为PCR产物，M为DL2000Marker) 第9页，共149页，2022年，5月20日

5、，8点15分，星期四琼脂糖凝胶电泳装置第10页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四实验步骤制 胶90以上熔化，凝胶温度35-43 EB第11页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四1231、孔深 2、预留尺寸 3、梳子宽度 1+2= 胶的厚度3第12页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四-+加缓冲液第13页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四拔梳子最好在电泳槽中第14页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四-+点 样第15页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四-+电 泳紫外第16

6、页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四第17页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四第18页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四第19页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四电泳结果分析DNA空间结构电压 EB第20页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四脉冲电场（PFGE） 解决大分子DNA电泳问题 第21页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四第22页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四Blotting第23页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，

7、星期四定义：印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNARNA或者DNA-DNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法第24页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四 (1) Southern 印迹杂交法 限

8、制性内切酶酶切 检测杂交信号 提取DNA Southern 法可用于检测特异的DNA序列片段,进行基因定位、分子量测定等。第25页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四Southern Blot Part I: Gel electrophoresis followed by transfer to a membraneDNA Cleaved with a restriction enzymeSmear of restriction fragments80度烘烤1-2h第26页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四Southern Blot Part II:

9、Hgybridization of DNA on membrane to specific probe第27页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四第28页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四DNA stained with ethidium bromideautoradiograph of hybridized membraneSouthern Blot第29页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四第30页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四第31页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四Northe

10、rn Blot probed with b-globinUndifferentiated cells+ differentiation factorNote: Make northern just like a Southern, except run out RNA samples rather than DNA Measures the steady-state level of mRNA transcript from a given geneSmear of RNA transcripts第32页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四 核酸杂交技术是目前研究核酸结构、

11、功能常用手段之一，不仅可用来检验核酸的缺失、插入，还可用来考察不同生物种类在核酸分子中的共同序列和不同序列以确定它们在进化中的关系，其主要应用如下图所示 ：第33页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四核酸杂交及其应用示意图.变性、复性和杂交。粗细线分别代表不同DNA。A是杂化双链.突变体的鉴别。B代表天然DNA；C是B的缺失突变体；虚线框内是已缺失的部分；D是显示从天然DNA链鼓出小泡 .粗线代表探针，粗线上的X表示放射性标记第34页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四 在核酸杂交的基础上发展起来的一种用于研究和诊断的非常有用的技术称探针技术(Probe

12、)。 探针技术在遗传性疾病诊断上已开始应用。 例如诊断地中海贫血或血红蛋白病，可以由已确诊的病人白细胞中提取DNA，这就是诊断探针。用诊断探针检查，不但可以对有症状患者进行确诊，还可以发现一些没有症状的隐性遗传性疾病。如从胎儿的羊水可以提取到少量DNA后，再用探针技术对此进行产前诊断各种遗传性疾病已在临床上开展。 杂交和探针技术是许多分子生物学技术的基础，在生物学和医学的研究中，以及临床诊断中得到了日益广泛的应用。第35页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四Western blot 实验技术 第36页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四Making a

13、probeUse the known amino acid sequence of a proteinSynthesise a short DNA sequence in vitroAA: phe met trp glu cys asnCodons: UUUC AUG UGG GAAG UGUC AAUCProbe: AAAG TAC ACC CTTC ACAG TTAG -P32第37页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四A short sequence of a protein is used to design a set of oligonucleotides fo

14、r use as a probe to recover the gene that encodedthe protein. One of the probe sequence will be a perfect match for thegene 第38页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四Western Blot基本原理 在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。第39页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四Western Blot一般流程蛋白样品的制备SDS聚丙烯酰胺 凝胶电泳转膜封闭一抗杂交二抗杂交底物

15、显色第40页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白水溶液提取法 针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统的水溶液 对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂 。 细胞裂解液： 50 mmol/L Tris-HCl, 150 mmol/L Nacl ,5 mmol/L EDTA, 1%NP40 ， 0.05% PMSF ， 2g/mL Aprotinin, 0.5g/mL Leupeptin ， pH8.0 有机溶剂提取法 对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，包括乙醇、 丙酮和丁醇等。通过层析或电洗脱法制备目的蛋

16、白蛋白样品的制备第41页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四蛋白样品的定量Bradford法 考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同颜色的形式，在一定浓度的乙醇和酸性条件下，可配成淡红色的溶液，与蛋白结合后形成蓝色化合物，该化合物在595nm处有最大吸收值，化合物颜色深浅与蛋白的浓度高低成正比 。(上样量)试剂：考马斯亮蓝工作液，0.1N盐酸，双蒸水，蛋白标准液（ 将10mg/ml蛋白溶液稀释至4.0mg/ml, 3.5mg/ml, 3.0mg/ml, 2.5mg/ml, 2.0mg/ml, 1.5mg/ml, 1.0mg/ml, 0.5mg/ml。）管号012345678d

17、dH2O807070707070707070蛋白标准液01010101010101010样品101010101010101010HCL101010101010101010第42页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳原理： SDS 是一种离子性的界面活性剂,它有强离子性的硫酸根离子也带有疏水性的长碳链.当 SDS 与蛋白质混合时,它会以其碳链与蛋白质之疏水性胺基酸结合将蛋白质包起来,而以硫酸根离子外露与水分子作用.大多数蛋白质和 SDS 的平均结合量是 1:1.4 (以重量为单位),而蛋白质结合固定比例之 SDS 後,由於 SDS 带强负价,使蛋白质原

18、先的带电价微不足道,且每单位重量之蛋白质带电价一致 (charge density),所以决定不同蛋白的泳动速率就只剩下分子大小一项因素第43页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四丙烯酰胺和N,N-亚甲双丙烯酰胺 SDS配胶的Tris缓冲液TEMED过硫酸铵(时间)Tris-甘氨酸电泳缓冲液凝胶成份第44页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四凝胶浓度与蛋白分离范围凝胶浓度（）线性分离范围（KD)1512-431016-687.536-945.057-212第45页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四第46页，共149页，2022年，5

19、月20日，8点15分，星期四转膜膜的选择尼龙膜硝酸纤维素膜封闭非特异性抗体结合麻烦简单快速封闭非特异性抗体结合价格昂贵价格便宜特殊要求下的选择需要更高的蛋白结合率（尼龙膜： 480g/cm2 ；硝酸纤维素膜：80g/cm2 ）目的蛋白与硝酸纤维膜的结合能力弱需要更大的机械强度第47页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四转膜半干法将凝胶和固相基质象三明治一样加在用缓冲液湿润滤纸之间，电转1030min。湿法将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装置的缓冲液中，电转45min或过夜。 第48页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四第49页，共149页，202

20、2年，5月20日，8点15分，星期四转膜后检测丽春红S染色蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤维素滤膜，换水几次。印度墨汁染色只用于放射性标记抗体或放射性标记A蛋白探针的Western印迹过程。 第50页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四封闭脱脂奶粉（5）BSAWestern Blot 膜封闭液（生物试剂公司提供）第51页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四一抗、二抗孵育把硝酸纤维素滤膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据滤膜面积以0.1ml/cm2的量加入加入一抗溶液与滤膜温育。37一小时，4 过夜。倒掉一抗溶液，用PBS漂洗液滤膜3次，每次10mi

21、n。加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动， 37一小时，4 过夜。倒掉一抗溶液，用PBS漂洗液滤膜3次，每次10min。第52页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四二抗与底物反应显色辣根过氧化物酶法（HRP）碱性磷酸酶法（AP）化学发光显色法(HRP)第53页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四Western Blot常见问题分析第54页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四SDS电泳胶不平？凝胶漏液？胶板洗刷干净加入APS和TEMED的量要合适加入试剂后摇匀，使其充分混合，防止部分胶块聚合不均匀温度合适，受热不均匀导致胶聚合不均匀两

22、块玻璃板底部要对齐第55页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四条带比正常的窄？“微笑”或“倒微笑”条带？凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合均匀，动作轻缓拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心，以免把上样带扭曲样品盐浓度过高会挤压其他条带导致宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度胶板底部有气泡会影响电泳效果，应赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否合适第56页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四转膜及抗体检测凝胶肿胀或卷曲？条带歪斜或漂移？单个或多个白点？转膜缓冲液过热？ 可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液中浸泡5-10min电转仪长期使用导致海绵变薄，“三明治”结构不紧凑导致。可

23、在两块海绵之间垫上少许普通的草纸确保膜和胶块之间没有气泡缓冲液中离子浓度太低，电流或电压太高。转膜过程注意降温第57页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四背景太高膜没有均匀浸湿膜或者缓冲液污染封闭不充分抗体与封闭剂出现交叉反应抗体浓度过高 原原因对策转膜前用100%甲醇将膜完全浸湿拿取膜与吸水纸时要戴手套，更换新鲜转膜缓冲液检测一抗、二抗与封闭剂是否有交叉反应杂交前检测一抗、二抗的工作浓度第58页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四Western blot is similar in concept to northern, except use pol

24、yacrylamide and run out proteinsSouthern, Northern, and Western analyses第59页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四免疫化学检测法第60页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四Using antibodies to detect a clone第61页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四重组体的转化利用物理方法导入、转化 1.质粒的Ca2+诱导转化 (E. coli ) 2.质粒的原生质体转化 3.质粒的高压电穿孔法转化 4.显微注射法转化 第62页，共149页，2

25、022年，5月20日，8点15分，星期四利用生物方法导入、转染1.细胞噬菌体DNA的转染2.动物病毒DNA的转染3.植物病毒DNA的转染第63页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四大肠杆菌感受态细胞的制备在不含抗生素的LB平板上涂布大肠杆菌DH5，于37培养过夜(16-20h)；挑一个单菌落接种于25mL无菌的LB 培养液中， 37中速震荡培养3h；将上述菌液在冰浴5分钟,然后在 4 ,4000rpm 离心10分钟;将细菌沉淀用5mL 预冷的CaCl2（0.1M）重悬，冰浴一会后于4 4000rpm离心10分钟；将细菌沉淀用1mL 预冷的CaCl2（0.1M）重悬，取200

26、uL用于细菌转化,其余菌液加入20%的无菌甘油,摇匀后于-20保存备用; 第64页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四感受态细胞的转化（1）取2L连接产物，加入80L感受态细胞，混匀，冰上放置30min。（2）将反应管快速转移42水浴中，热击90s。（3）将反应管快速转移至冰上2min（4）加入500-800 L LB液体培养基。（5）37，150 rpm复苏1.5 h。（6）取100L菌液涂布于LB固体培养基上（含100g/mL的Amp）（7）37下培养16-24 h。第65页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四Transforming E.coli

27、with recombinant DNA第66页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四Growth of Bacteria第67页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四第68页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四PCR技术及其应用 第69页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四目 录PCR的概念 PCR技术的创建PCR的原理PCR的反应体系和方法PCR的类型和应用第70页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四 多聚酶链式反应（PCR：Polymerase Chain Reaction)Polymeras

28、e: DNA聚合酶 第71页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四基因组DNA引物DNA聚合酶DNA片段体外扩增第72页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四PCR技术的创建Kary B. Mullis（穆利斯（美）Khorana(1971)等提出在体外经DNA变性,与适当引物杂交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设想。 1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现。 1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术 1989年美国Science杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸

29、年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。第73页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四PCR技术简史PCR的最早设想： 本世纪60年代末、70年代初人们致力于研究基因的体外分离技术，Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。 PCR技术第74页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGG

30、ATCG35解旋酶解链酶DNA解旋解链合成引物子链延长PCR技术第75页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5AUCGCG5引物酶引物酶RNA引物RNA引物PCR技术第76页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCG

31、CTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5AUCGCG5TAGCGCTATCGCATCGACGCT3ATAGCGTAGCTGCGACCTAGC3DNA聚合酶DNA聚合酶PCR技术第77页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四PCR技术简史PCR的改进与完善：Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的一个片段，其缺点是：此酶不耐高温， 90会变性失活，每次循环都要重新加。PCR技术第78页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四其PCR产物特异性较差，合成的DNA片段不均一。 引物链延伸

32、反应在37下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，此种酶催化的PCR技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点，但由于酶不耐热，在DNA模板进行热变性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期，给PCR技术操作程序添了不少困难。这使得PCR技术在一段时间内没能引生物医学界的足够重视。PCR技术PCR技术简史第79页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四945537第80页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四PCR技术简史1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR，其扩增的DNA片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种DN

33、A片段。但每循环一次，仍需加入新酶。PCR技术第81页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四Taq DNA聚合酶的特点：耐高温，在70下反应2h后其残留活性大于原来的90%，在93下反应2h后其残留活性是原来的60%，在95下反应2h后其残留活性是原来的40%。在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度(2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。PCR技术PCR技术简史第82页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)酶

34、活性(%)温度()40 50 60 70 80 90 100100 80 60 40 201988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术第83页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四729455PCR循环第84页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四PCR技术的原理1 PCR技术的基本原理 无细胞分子克隆法：在微量离心管中,加入适量的缓冲液, 微量的模板DNA,四种脱氧单核苷酸,耐热性多聚酶, 一对合成DNA的引物,通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终

35、使基因放大了数百万倍; 扩增了特异区段的DNA带。 第85页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四加热变 性复性复温DNA的变性和复性加热或强酸、碱性作用可以使 DNA双螺旋的氢键断裂,双链解离,形成单链DNA,这称为 DNA的变性。解除变性的条件后, 变性的单链可以重新结合起来,形成双链,其原有的特性和活性可以恢复,这称DNA复性, 也叫退火。 第86页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四PCR反应条件PCR过程第87页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四PCR反应条件PCR过程第88页，共149页，2022年，5月20日，8点15分

36、，星期四PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程1234522557294时间（min）温度（）适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍PCR技术第89页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点1234522557294时间（min）温度（）适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍DNA变性形成2条单链模板DNA95PCR技

37、术复习第90页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点9550引物1引物2DNA引物PCR技术第91页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶PCR技术第92页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72第1轮结束95第2轮开始PCR技术第93页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的

38、特点955072TaqTaqTaqTaqPCR技术第94页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72第2轮结束PCR技术第95页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点重复30轮后230=1,073,741,824模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增PCR技术第96页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四2 PCR技术的特点1 ）高度的灵敏性30轮循环扩增量达230个拷贝（109拷贝）PCR产物每轮循环增加

39、一倍第97页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四2 ）特异性引物引物 引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键。 引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。第98页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四引物设计：（1)序列应位于高度保守区,与非扩增区无同源序列。（2）引物长度以15-40 bp为宜。（3）碱基尽可能随机分布,G+C占50-60%。（4）引物内部避免形成二级结构。（5）两引物间避免有互补序列。（6）引物3端为关键碱基；5端无严格限制。第99页，共149页，2022年，5月20日，8点15

40、分，星期四3）操作简便易行 PCR扩增法,只需要数小时,就可以用电泳法检出1g基因组DNA中仅含数个拷贝的模板序列。 通常的DNA 扩增法是分子克隆法, 首先要构建含有目的的基因的载体, 然后将它导入细胞后进行扩增,还要用同位索探针进行筛选;这种方法,要经过DNA内切、连接、转化和培养等相关的过程,操作复杂,一般需要数周时间。第100页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四目的基因载体复制子宿主细胞扩增扩增提取DNA分子第101页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四4 ）用途广泛生命学科医学工程遗传工程疾病诊断法医学考古学第102页，共149页，2022年

41、，5月20日，8点15分，星期四PCR的反应体系和方法 PCR管加热使模板变性, 退火使引物与模板DNA互补,延伸需将反应温度升至中温( 72),在Tap多聚酶的作用下,以dNTP为原料,以引物为复制的起点,合成新链。 如此重复改变反应温度,即高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍; 将扩增产物进行电泳,经溴化乙锭染色,在紫外灯照射下肉眼能见到扩增特异区段的DNA带。第103页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四1 反应体系标准的PCR反应体系4种dNTP混合物 各200u

42、mol/L引物 各10100pmol模板DNA 0.12ugTaq DNA聚合酶 2.5uBuffer （Mg2+ ） 1.5mmol/LPCR技术第104页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四PCR技术的基本过程(1)模板DNA dNTP 引物Buffer预变性模板DNA dNTP 引物BufferTaqDNA聚合酶94oC52 基本过程第105页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四PCR技术的基本过程(2)Taq 酶模板DNA dNTP 引物Buffer循环仪9455 72 Taq 酶模板DNA dNTP 引物Buffer72 57 min循环253

43、5次第106页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四琼脂糖凝胶电泳PCR技术的基本过程(3)第107页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四1）PCR反应成分（1）模板 单、双链DNA均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。 一般100ng DNA模板/100L。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。3 PCR反应条件第108页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四（2）引物浓度 0.1-0.5 mol/L 浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。（3）Taq DNA聚合酶（thermus aquati

44、cus) 0.5-2.5 U/50 l 酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。第109页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四（4）dNTP dNTP浓度取决于扩增片段的长度 四种dNTP浓度应相等 浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降低反应产量 dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度下降,影响DNA聚合酶的活性。第110页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四（5） Mg2+ Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高影响反应特

45、异性。Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。第111页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四2）循环参数变性 使双链DNA解链为单链 94oC 20-30秒(2) 退火 温度由引物长度和GC含量决定。 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。第112页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四（3）延伸 70-75,一般为72 延伸时间由扩增片段长度决定（4）循环次数 主要取决于模版DNA的浓度 一般为25-35次 次数过多：扩增效率降低 错误掺入率增加第113页，共149页，2

46、022年，5月20日，8点15分，星期四经典循环参数（500bp以内）94 30s 55 45s72 1min94 5min30次72 7min42 forever第114页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四1）不对称PCR 目的：扩增产生特异长度的单链DNA。 方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.010.5M,关键是限制性引物的绝对量。 用途：制备核酸序列测定的模板 制备杂交探针 基因组DNA结构功能的研究 PCR的类型第115页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四 高浓度引物低浓度引物第116页，共1

47、49页，2022年，5月20日，8点15分，星期四2)反向PCR (reverse PCR) 是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。 可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆,扩增基因文库的插入DNA；建立基因组步移文库。已知序列未知序列未知序列第117页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四已知序列未知序列未知序列限制酶限制酶连接酶第118页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四3）多重PCR（复合PCR）用于检测特定基因序列的存在或缺失。第119页

48、，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四电泳引物12341234第120页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四DMD：人类肌营养不良基因A：无外显子8,12,17,19对应条带,说明病人外显子819缺失B：病人A中未扩增外显子带的强度为C的一半,提示为区域缺失携带者C：正常人DMD基因外显子的一般扩增形式多重PCR检测DMD基因缺失第121页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四第122页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四4）LP-PCR（Labelled primers) 利用同位素、荧光素等对引物进行标记,用以直观

49、地检测目的基因。 特别适合大量临床标本的基因诊断 可同时检测多种基因成分病毒1 病毒2 病毒 3 病毒4第123页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四标记引物观察PCR产物第124页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四5）PCR固相分析法模板生物素化引物PCR扩增探针亲和固相介质检测探针信号可用于基因芯片的制作第125页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四6）逆转录酶聚合酶mRNAcDNA杂化双链PCR扩增第126页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四基因mRNA蛋白质多肽链第127页，共149页，2022年，5月20日，8点15分，星期四7) 荧光定量 PCR（real-time PCR) 通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标