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文档简介
1、关于基因的表达与调控上第1页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四概述一、基因表达的概念gene expression :基因转录及翻译的过程。对这个过程的调节就称为gene regulation 。rRNA、tRNA编码基因转录合成RNA的过程也属于基因表达。第2页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四 组成性表达(constitutive expression) 适应性表达(adaptive expression)二、基因表达的方式第3页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四 1、组成型表达: 指不大受环境变动而变化的一类基因表达。某些
2、基因在一个个体的几乎所有细胞中持续表达,通常被称为管家基因(housekeeping gene)。无论表达水平高低,管家基因较少受环境因素影响,而是在个体各个生长阶段的大多数或几乎全部组织中持续表达,或变化很小。区别于其他基因,这类基因表达被视为组成型表达(constitutive expression)。第4页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四 2、适应性表达 指环境的变化容易使其表达水平变动的一类基因表达。 应环境条件变化基因表达水平增高的现象称为诱导(induction),这类基因被称为可诱导的基因(inducible gene);相反,随环境条件变化而基因表达水平
3、降低的现象称为阻遏(repression),相应的基因被称为可阻遏的基因(repressible gene)。 在一定机制控制下,功能上相关的一组基因,无论其为何种表达方式,均需协调一致、共同表达,即为协调表达(coordinate expression),这种调节称为协调调节(coordinate regulation)。第5页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四三、基因表达的规律 时间性和空间性1、时间特异性(temporal specificity)按功能需要,某一特定基因的表达严格按特定的时间顺序发生,称之为基因表达的时间特异性。多细胞生物基因表达的时间特异性又称阶
4、段特异性(stage specificity)。 第6页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四2、空间特异性(spatial specificity)基因表达伴随时间顺序所表现出的这种分布差异,实际上是由细胞在器官的分布决定的,所以空间特异性又称细胞或组织特异性(cell or tissue specificity)。在个体生长全过程,某种基因产物在个体按不同组织空间顺序出现,称之为基因表达的空间特异性。第7页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四四、基因表达调控的生物学意义适应环境、维持生长和增殖(原核、真核)维持个体发育与分化(真核)第8页,共145页,
5、2022年,5月20日,8点18分,星期四五、基因表达调控的层次转录水平 基因结构活化转录起始(基因表达基本控制点) 转录后水平转录后加工转录产物的转运翻译水平翻译调控翻译后加工蛋白质降解第9页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四六、转录水平-基因转录激活调节基本要素 (一) 特异DNA序列 (二) 调节蛋白 (三) RNA聚合酶第10页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四原核生物的特异DNA序列 原核生物基因表达与调控是通过操纵子机制来实现的。 操纵子 是由功能上相关联的多个编码序列(结构基因)及其上游的调控序列成簇串联在一起构成的一个转录协调单位。
6、调控序列 包括操纵序列(O)、启动序列(P)和调节基因(I/R)等组件。 (一)特异DNA序列第11页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四 操纵子调节基因 启动序列 操纵序列 编码序列(结构基因) 表达 转录ICAPPOZYA阻遏蛋白结合部位RNA聚合酶结合部位启动序列(P): 其中的-35区 -10区是RNA聚合酶识别并结合的部位。 多顺反子mRNA阻遏蛋白(负性调节) ( 正性调节)多种蛋白质第12页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四真核生物的特异DNA序列 真核生物基因组中含有可以调控自身基因表达的特异DNA序列,称为顺式作用元件。 顺式作用元件
7、能够被各种转录调节蛋白特异识别和结合,从而影响基因表达活性。 启动子 顺式作用元件又分 增强子 沉默子第13页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四1) 顺式作用元件(cis-acting element)可影响自身基因表达活性的DNA序列BADNA编码序列转录起始点不同真核生物的顺式作用元件中也会发现一些共有序列 ,如TATA盒、CAAT盒等,这些共有序列是RNA聚合酶或特异转录因子的结合位点。第14页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四(二)调节蛋白原核生物的调节蛋白(3类)特异因子 决定RNA聚合酶对启动序列的特异识别和结合能力; (如,RNA聚合酶
8、的 因子)阻遏蛋白 通过与操纵序列结合,阻遏基因转录,发挥负性调控作用; (由调节基因表达的阻遏蛋白)激活蛋白 与启动子上游DNA序列结合,促进RNA聚合酶转录活性,发挥正性调控作用。(如,CAP分解代谢物基因活化蛋白)第15页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四 2. 真核生物的调节蛋白 反式作用因子 能直接或间接与顺式作用元件相互作用,进而调控基因转录的一类调节蛋白,统称为反式(作用)因子。(trans-acting factor) 按其功能不同,常有以下三类: 基本转录因子 转录调节因子 共调节因子 第16页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四(1
9、) 基本转录因子(TF) 是指能够在启动子部位与核心序列TATA盒和RNA Pol结合,形成转录前起始复合物(PIC)的一类调节蛋白,以起动转录。 与RNA聚合酶(RNA Pol )结合的(基本)转录因子有:TFA,TFB,TFD,TFE,TFF,TFH, TFJ 等。 首先由TFD与启动子TATA盒结合,然后按一定的时空顺序依次结合RNA Pol和其它转录因子,形成PIC。 第17页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四(2) 转录调节因子 这类调节蛋白能识别并结合转录起始点上游的调控序列或远端的增强子元件,通过蛋白质-DNA相互作用而影响转录活性。 起激活转录作用转录激活
10、因子; 起阻遏转录作用转录阻遏因子。(3) 共调节因子 另有一类与转录调节因子发生蛋白蛋白相互作用,进而影响它们的分子构象,影响转录活性,称共调节因子。 如果与转录激活因子有协同作用共激活因子; 与转录阻遏因子有协同作用共阻遏因子。第18页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四7.1原核基因表达调控总论7.1.1 原核基因表达调控的类型与特点1、根据操纵子对调节蛋白(阻遏蛋白或激活蛋白) 的应答,正转录调控负转录调控调节基因RNA调节蛋白第19页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四调节基因操纵基因结构基因激活蛋白正转录调控正转录调控如果在没有调节蛋白质存在
11、时基因是关闭的,加入这种调节蛋白质后基因活性就被开启,这样的调控正转录调控。第20页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四调节基因操纵基因结构基因阻遏蛋白负转录调控负转录调控在没有调节蛋白质存在时基因是表达的,加入这种调节蛋白质后基因表达活性便被关闭,这样的调控负转录调控。第21页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四 根据辅因子(小分子)结合后调控效果,可分: 开启调控系统中结构基因的转录活性 诱导关闭调控系统中结构基因的转录活性 阻遏 操纵子调控系统的基本类型可诱导负控制系统可诱导正控制系统可阻遏负控制系统可阻遏正控制系统第22页,共145页,2022年
12、,5月20日,8点18分,星期四第23页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四几个概念:诱导物(inducer):指当作用于细胞群体时,通过诱导机制、能增加特定基因转录的mRNA含量的一种化学因子或物理因子,辅阻遏物(corepressor ):一种能与阻遏蛋白形成功能阻遏物,而使合成代谢的操纵子受到阻遏的代谢终产物。 第24页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四正调控与负调控并非互相排斥的两种机制,而是生物体适应环境的需要,有的系统既有正调控又有负调控;原核生物以负调控为主,真核生物以正调控为主;降解代谢途径中既有正调控又有负调控;合成代谢途径中一般以负
13、调控来控制产物自身的合成。第25页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四可诱导调节可阻遏调节7.1.2 原核基因表达调控的主要特点7.1.3 弱化子对基因活性的影响7.1.4 降解物对基因活性的影响7.1.5 细菌的应急反应第26页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四1、Discovery of Operon 1961年, F. Jacob & J.Monod提出, 此后不断完善。获1965年诺贝尔生理学和医学奖1940年, Monod发现:细菌在含葡萄糖和乳糖的培养基上生长时,细菌先利用葡萄糖,葡萄糖用完后,才利用乳糖;在糖源转变期,细菌的生长会出现停顿
14、。即产生细胞中存在两种酶,即组成酶与诱导酶1947年,报告:“酶的适应现象及其在细胞分化中的意义”Francis Jacob Jacques Monod 7.2 乳糖操纵子与负控诱导系统第27页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四1951年,Monod与Jacob合作,发现两对基因:Z基因:与合成-半乳糖苷酶有关;I基因:决定细胞对诱导物的反应。Szilard:I基因决定阻遏物的合成,当阻遏物存在时,酶无法合成,只有有诱导物存在,才能去掉该阻遏物。 Jacob:结构基因旁有开关基因(操纵基因),阻遏物通过与开关基因的结合,控制结构基因的表达。第28页,共145页,2022年
15、,5月20日,8点18分,星期四操纵子是一种完整的具有特定功能的细菌基因表达和调节的单位,包括调节基因,操纵位点,结构基因,组成一个控制单元。 结构基因:产生mRNA,合成蛋白质 操纵位点 operator:启动子结合位点 调节基因:产生调节蛋白(与操纵位点结合) 结构基因不转录 诱导物存在时,可与阻遏蛋白结合 结构基因转录2、操纵子的定义第29页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四7.2.1 酶的诱导lac体系受调控的证据第30页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四细菌对乳糖的利用及其相关的酶: 乳糖 (在通透酶作用下进入细菌) -半乳糖苷酶 别构乳糖
16、 -半乳糖苷酶 葡萄糖+半乳糖 -半乳糖苷乙酰基转移酶第31页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四1) lac操纵子的本底水平(basal level)表达有两个矛盾是操纵子理论所不能解释的:诱导物需要穿过细胞膜才能与阻遏物结合,而转运诱导物需要透过酶,后者的合成有需要诱导。真正的诱导物是异构乳糖而非乳糖,前者是在-半乳糖甘酶的催化下由乳糖形成的,因此,需要有-半乳糖甘酶的预先存在。 一些诱导物可以在透过酶不存在时进入细胞? 一些透过酶可以在没有诱导物的情况下合成?解释:本底水平的组成型合成:非诱导状态下有少量的lac mRNA合成。第32页,共145页,2022年,5月2
17、0日,8点18分,星期四分解底物的酶只有在底物存在时才出现!无乳糖时,几个b-gal/cell 加入乳糖时,5000个 乳糖的诱导作用是由酶前体转化而来,还是诱导新酶合成? 培养基(35S-aa, 无乳糖) E. coli繁殖 培养基(无35S -aa, 加入乳糖) -gal(无35S)第33页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四大肠杆菌对乳糖的反应 培养基:甘油 按照lac操纵子本底水平的表达,每个细胞内有几个分子的-半乳糖苷酶和-半乳糖苷透过酶;培养基:加入乳糖少量乳糖透过酶进入细胞-半乳糖苷酶异构乳糖诱导物诱导lac mRNA的生物合成大量乳糖进入细胞多数被降解为葡萄
18、糖和半乳糖(碳源和能源)异构乳糖第34页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四乙酰基转移酶半乳糖苷透性酶-半乳糖苷酶操纵位点调节基因7.2.2 lac Operon的模型及其影响因子第35页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四Z编码-半乳糖苷酶:将乳糖水解成葡萄糖和半乳糖Y编码-半乳糖苷透过酶:使外界的-半乳糖苷(如乳糖)能透过大肠杆菌细胞壁和原生质膜进入细胞内。A编码-半乳糖苷乙酰基转移酶:乙酰辅酶A上的乙酰基转到-半乳糖苷上,形成乙酰半乳糖。第36页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四mRNA阻遏蛋白IDNAZYAOPpol没有乳糖
19、存在时阻遏蛋白的调节阻遏基因1.乳糖操纵子调控模型第37页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四mRNA阻遏蛋白有乳糖存在时IDNAZYAOPpol启动转录mRNA乳糖别构乳糖 -半乳糖苷酶第38页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四(1)mRNA分子的启动子紧接着O区,而位于I与O之间的启动子区(P),不能单独起动合成-半乳糖苷酶和透过酶的生理过程。2. 乳糖操纵子调控机制阻遏物lac I基因产物及功能 lac 操纵子阻遏物mRNA是由弱启动子控制下组成型合成的,每个细胞中有5-10个阻遏物分子。 当I基因由弱启动子突变成强启动子,细胞内就不可能产生足够
20、的诱导物来克服阻遏状态,整个lac操纵子在这些突变体中就不可诱导。第39页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四RNA聚合酶结合部位阻遏物结合部位(2)操纵基因是DNA上的一小段序列(仅为26bp),是阻遏物的结合位点。第40页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四操纵位点的回文序列第41页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四(3)当阻遏物与操纵基因结合时,lac mRNA的转录起始受到抑制。第42页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四(4)诱导物通过与阻遏物结合,改变它的三维构象,使之不能与操纵基因结合,从而激发la
21、c mRNA的合成。当有诱导物存在时,操纵基因区没有被阻遏物占据,所以启动子能够顺利起始mRNA的合成。第43页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四 阻遏蛋白单体的结构阻遏蛋白单体的三级结构第44页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四第45页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四乳糖(5)诱导物不是乳糖乳糖代谢生成lac诱导物Allolctose 异构乳糖 别构乳糖-半乳糖苷酶第46页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四IPTG,异丙基- D-硫代半乳糖苷TMG ,巯甲基半乳糖苷ONPG, O-硝基半乳糖苷在研究诱导
22、作用时,很少使用乳糖安慰诱导物(gratuitous inducer): 如果某种物质能够促使细菌产生酶而本身又不被分解,这种物质被称为安慰诱导物,如:第47页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四第48页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四-complementationlacZM15 基因是缺失了编码 -半乳糖苷酶中第 11-41 个氨基酸的 lacZ 基因,无酶学活性。对于只编码 N-端 140 个氨基酸的 lacZ 基因 (称为 lacZ) ,其产物也没有酶学活性。但这两个无酶学活性的产物混合在一起时,可恢复-半乳糖苷酶的活性,实现基因内互补。在
23、lacZ编码区上游插入一小段 DNA 片段(如 51 个碱基对的多克隆位点),不影响 -半乳糖苷酶的功能内互补。但是,若在该 DNA 小片段中再插入一个片段,将几乎不可避免地导致产生无-互补能力的 -半乳糖苷酶片段。利用这一互补性质,可用于筛选在载体上插入了外源片段的重组质粒。在相应的载体系统中,lacZM15 放在 F 质粒上, 随宿主传代; lacZ 放在载体上, 作为筛选标记。XL1-Blue菌株基因型:endA1 gyrA96(nalR) thi-1 recA1 relA1 lac glnV44 FTn10 proAB+ lacIq (lacZ)M15 hsdR17(rK- mK+)第
24、49页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四+ glucose- glucoseTime (hr)Units of b-galactosidase+ lactoseGlucose added(6)葡萄糖对lac操纵子的影响代谢物阻遏效应实验,在LacGlu培养基上 E.coli只利用G,只有G 耗尽时,才会利用lac葡萄糖抑制lac mRNA的转录: 可阻止诱导物引起的阻遏物失活效应,仅去掉阻遏物并不能启动lac基因表达,有其它因素参与分解代谢阻遏(catabolite repression)第50页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四只有当以乳糖为唯一碳
25、源时,-半乳糖苷酶的合成才增加。但是在以乳糖和葡萄糖为碳源时,如果加入cAMP,-半乳糖苷酶的合成速率也会大大提高,可达到只用乳糖为碳源时的水平。这说明,cell内cAMP的浓度能影响到-半乳糖苷酶的合成速率。葡萄糖对lac操纵子表达的抑制是间接的 第51页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四ATP腺甘酸环化酶cAMP(环腺甘酸) 大肠杆菌中:无葡萄糖,cAMP浓度高; 有葡萄糖,cAMP浓度低cAMP(环化腺苷一磷酸,cyclic AMP)1965年,B. Magasonik发现在大肠杆菌中也含有cAMP,而且菌株内cAMP的含量常随细胞的生理状态发生变化,即当细胞处于碳
26、源饥饿条件下,cAMP水平显著提高,反之在细胞生长的培养基中含有大量葡萄糖时,cAMP水平明显降低;第52页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四腺苷环化酶腺苷酸环化酶位于细胞膜上,其活性与葡萄糖运输的酶有关,因此cAMP调控乳糖、半乳糖、阿拉伯糖等其他糖类代谢有关的酶。第53页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四第54页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四 葡萄糖的降解是通过cAMP与 CAP结合起作用。 CAP, catabolite activator protein,由crp编码CRP, catabolite receptor
27、protein代谢物激活蛋白(CAP)/环腺甘酸受体蛋白(CRP)CAP激活转录? (1)可能直接和RNA Pol相互作用; (2)作用于DNA,改变其结构,从而帮助RNA Pol结合。第55页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四CAP结合位点CAP为二聚体, 45KD ,被cAMP激活结合位点22bp I -70 -50 II -50 -40第56页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四CAP的结合对DNA构型的影响DNA弯曲弯曲点位于CAP结合位点二重对称的中心弯曲使CAP能与启动子上的RNA pol 接触第57页,共145页,2022年,5月20日,
28、8点18分,星期四+ + + + 转录无葡萄糖,cAMP浓度高时促进转录有葡萄糖,cAMP浓度低时不促进转录ZYAOPDNACAPCAPCAPCAPCAPCAPCAP的正调控第58页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四当阻遏蛋白封闭转录时,CAP对该系统不能发挥作用如无CAP存在,即使没有阻遏蛋白与操纵序列结合,操纵子仍无转录活性。 cAMPCAP复合物与启动子区的结合是转录起始所必需的。协调调节葡萄糖对 lac 操纵子的阻遏作用称分解代谢阻遏(catabolic repression)。 单纯乳糖存在时,细菌利用乳糖作碳源;若有葡萄糖或葡萄糖/乳糖共同存在时,细菌首先利用
29、葡萄糖。第59页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四ZYAOPDNA 调控区CAP结合位点启动序列操纵序列 结构基因Z: -半乳糖苷酶Y: 通透酶A:乙酰基转移酶cAMPCAP复合物第60页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四The lac Operon:When Glucose Is Present But Not LactoseRepressorPromoterLacYLacALacZOperatorCAPBindingRNAPol.RepressorRepressorRepressor mRNAHey man, Im constitutiveCom
30、e on, let me throughNo wayJose!CAP第61页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四The Lac Operon:When Glucose And Lactose Are PresentRepressorPromoterLacYLacALacZOperatorCAPBindingRepressorRepressor mRNAHey man, Im constitutiveCAPLacRepressorRepressorXRNAPol.RNAPol.Great, I can transcribe!Some transcription occurs,
31、 but at a slow rateThis lactose has bent me out of shape第62页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四The lac Operon:When Lactose Is Present But Not GlucoseRepressorPromoterLacYLacALacZOperatorCAPBindingRepressorRepressor mRNAHey man, Im constitutiveCAPcAMPLacRepressorRepressorXThis lactose has bent me out of sha
32、peCAPcAMPCAPcAMPBind to mePolymeraseRNAPol.RNAPol.Yipee!第63页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四The Lac Operon:When Neither Lactose Nor Glucose Is PresentRepressorPromoterLacYLacALacZOperatorCAPBindingCAPcAMPCAPcAMPCAPcAMPBind to mePolymeraseRNAPol.RepressorRepressor mRNAHey man, Im constitutiveRepressorSTO
33、PRight therePolymeraseAlright, Im off to the races . . .Come on, let me through!第64页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四Summary of lac operon regulationGlucosecAMPLactoseTranscription of lac mRNAHighLowPresentlow rate of expressionHighLowAbsentessentially noneLowHighAbsentessentially noneLowHighPresenthigh
34、rate of expression第65页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四lac operon 的其它问题lac operon的功能是在正负两个调控体系的协调作用(coordinate regulation)下实现的。阻遏蛋白封闭转录时,CAP不发挥作用;如没有CAP加强转录,即使阻遏蛋白从P上解聚仍无转录活性CAP组成型合成,所以cAMPCAP复合物取决于cAMP含量腺苷酸环化酶位于细胞膜上,其活性与葡萄糖运输的酶有关,因此cAMPCAP调控乳糖、半乳糖、阿拉伯糖等糖类代谢有关的酶降解物敏感型操纵子:只要有葡萄糖存在,这些操纵子就不表达第66页,共145页,2022
35、年,5月20日,8点18分,星期四2. A基因及其生理功能 编码b-半乳糖苷乙酰基转移酶,使半乳糖苷乙酰化。该酶不参与乳糖代谢! 生理意义:在细胞中有许多能被半乳糖苷酶降解的半乳糖苷类物质,其分解产物不能进一步代谢,积累,抑制细胞生长。半乳糖苷乙酰化后,即无毒. 所以lacA虽不在乳糖降解中起作用,但可抑制有害物质的积累3. lac基因产物数量, 1:0.5:0.2 不同酶的数量差异,是由于在翻译水平上的调节. 方式有二:核糖体脱离;多顺反子的差别性翻译 内切酶作用: 在lac mRNA分子内部,a基因比z基因更易受内切酶作用第67页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四总结
36、-乳糖操纵子的作用机制1、乳糖操纵子的组成:大肠杆菌乳糖操纵子含Z、Y、A三个结构基因,分别编码半乳糖苷酶、透酶和半乳糖苷乙酰转移酶,此外还有一个操纵序列O,一个启动子P和一个调节基因I。2、阻遏蛋白的负性调节:没有乳糖存在时,I基因编码的阻遏蛋白结合于操纵序列O处,乳糖操纵子处于阻遏状态,不能合成分解乳糖的三种酶;有乳糖存在时,乳糖作为诱导物诱导阻遏蛋白变构,不能结合于操纵序列,乳糖操纵子被诱导开放合成分解乳糖的三种酶。所以,乳糖操纵子的这种调控机制为可诱导的负调控。第68页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四3、CAP的正调节:在启动子上游有CAP结合位点,当大肠杆菌从
37、以葡萄糖为碳源的环境转变为以乳糖为碳源的环境时,cAMP浓度升高,与CAP结合,使CAP发生变构,CAP结合于乳糖操纵子启动序列附近的CAP结合位点,激活RNA聚合酶活性,促进结构基因转录,调节蛋白结合于操纵子后促进结构基因的转录,对乳糖操纵子实行正调控,加速合成分解乳糖的三种酶。4、协调调节:乳糖操纵子中的I基因编码的阻遏蛋白的负调控与CAP的正调控两种机制,互相协调、互相制约。总结-乳糖操纵子的作用机制第69页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四7.4 其他操纵子Galactose OperonArabinose Operon第70页,共145页,2022年,5月20日
38、,8点18分,星期四7.4.1半乳糖操纵子大肠杆菌半乳糖操纵子(galactose operon)包括3个结构基因: 异构酶(UDP-galactose-4epimerase, galE),半乳糖-磷酸尿嘧啶核苷转移酶(galactose transferase, galT)半乳糖激酶(galactose kinase, galk)。第71页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四Map of the E. coli gal operon and nucleotide sequence of the regulatory region 3个酶的作用:使半乳糖变成葡萄糖-1-磷酸
39、。galR与galE、T、K及操纵区O等离得很远,而galR产物对galO的作用与lacI-lacO的作用相同。第72页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四gal操纵子的特点: 它有两个启动子,其mRNA可从两个不同的起始点开始转录; 它有两个O区,一个在P区上游-67-53,另一个在结构基因galE内部。CAP, catabolite activator protein,由crp编码CRP, catabolite receptor protein代谢物激活蛋白(CAP)/环腺甘酸受体蛋白(CRP)第73页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四因为半乳糖的
40、利用效率比葡萄糖低,人们猜想葡萄糖存在时半乳糖操纵子不被诱导,但实际上有葡萄糖存在时,gal操纵子仍可被诱导。现已分离到一些突变株,其中一类突变株能在不含葡萄糖的培养基中高水平合成半乳糖代谢酶类(gal结构基因高效表达);而另一类突变株中gal基因的表达完全依赖于葡萄糖,培养基中如无葡萄糖存在,这些细菌的gal基因不表达,不合成半乳糖代谢酶类。第74页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四分析gal操纵子P-O区的DNA序列发现,该操纵子确实存在两个相距仅5bp的启动子,可以分别起始mRNA的合成。每个启动子拥有各自的RNA聚合酶结合位点S1和S2。从S1起始的转录只有在培养
41、基中无葡萄糖时,才能顺利进行,RNA聚合酶与S1的结合需要半乳糖、CAP和较高浓度的cAMP。从S2起始的转录则完全依赖于葡萄糖,高水平的cAMP-CAP能抑制由这个启动子起始的转录。当有cAMP-CAP时,转录从S1开始,当无cAMP-CAP时,转录从S2开始。1. cAMP-CRP对gal启动子的作用第75页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四为什么gal操纵子需要两个转录起始位点?半乳糖不仅可以作为唯一碳源供细胞生长,而且与之相关的物质-尿苷二磷酸半乳糖(UDP-gal)是大肠杆菌细胞壁合成的前体。在没有外源半乳糖的情况下,UDP-gal是通过半乳糖差向异构酶的作用由
42、UDP-葡萄糖合成的,该酶是galE基因的产物。异构酶(UDP-galactose-4epimerase, galE),第76页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四 生长过程中的所有时间里细胞必须能够合成差向异构酶。现在设想只有S1一个启动子,那么由于这个启动子的活性依赖于cAMP-CRP,当培养基中有葡萄糖存在时就有能合成异构酶。 假如唯一的启动子是S2,那么,即使在葡萄糖存在的情况下,半乳糖也将使操纵子处于充分诱导状态,这无疑是一种浪费。无论从必要性或经济性考虑,都需要一个不依赖于cAMP-CAP的启动子(S1)对高水平合成进行调节。第77页,共145页,2022年,5
43、月20日,8点18分,星期四 在E. coli中阿拉伯糖的降解需要3个基因:araB、araA和araD,形成一个基因簇,简写为araBAD 分别编码阿拉伯糖代谢需要的三种酶:核酮糖激酶(ribulose kinase),阿拉伯糖异构酶(arabinose isomerase) 核酮糖-5-磷酸差向异构酶(ribulose-5-phosphate eimerase)7.4.2 阿拉伯糖操纵子第78页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四 araBAD和araC基因的转录是以相反的方向进行的。在标准的遗传学图谱上,araBAD基因簇从启动子PBAD开始向右进行转录,而araC基
44、因则是从Pc向左转录。复合启动子区主要有:1、PBAD区:Ara BAD启动子区2、araC位点:C蛋白阿拉伯糖复合物与操纵子结合区3、-280区:是C蛋白与操纵子结合区第79页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四结构:具有正负调节功能的操纵子与araB、araA和araD这3结构基因相邻的是一个复合启动子区和一个调节基因C,由调节基因C合成的AraC蛋白是一个自我调节蛋白(autoregulated protein),它既是ara操纵子的正调节蛋白,又是ara操纵子的负调节蛋白。第80页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四1. 阿拉伯糖操纵子的调节机制
45、第81页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四第82页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四ara操纵子的调控有三个特点:第一,araC表达受到AraC的自动调控。第二,AraC既可充当阻遏物,也可作为激活剂。第三,AraC与CAP结合可充分诱导ara操纵子。第83页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四 AraC蛋白作为PBAD活性正、负调节因子的双重功能是通过该蛋白的两种异构体来实现的。Pr是起阻遏作用的形式,而Pi是起诱导作用的形式,它通过与PBAD启动子结合进行调节。 在没有阿拉伯糖时,Pr形式占优势;一旦有阿拉伯糖存在,它就能够与
46、AraC蛋白结合,使平衡趋向于Pi形式。这样,阿拉伯糖的诱导作用就可以解释为阿拉伯糖与Pr的结合,使Pr离开它的结合位点,然后,产生大量的Pi,并与启动子结合。第84页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四 因为培养基中含有葡萄糖,所以cAMP-CAP没有与操纵区位点相结合,AraC蛋白处于Pr形式并与A位点结合,RNA聚合酶很少再与Pc结合,araC基因虽然仍有转录,但受到抑制,只有少量 AraC蛋白形成,整个系统几乎处于静止状态。 没有葡萄糖,也没有阿拉伯糖,因为没有诱导物,尽管有cAMP-CAP与操纵区位点相结合,AraC蛋白仍以Pr形式为主,无法与操纵区B位点相结合,
47、无araBAD mRNA转录。无葡萄糖,有阿拉伯糖时,大量araC基因产物以Pi形式存在,并分别与操纵区B、A位点相结合,在cAMP-CAP的共同作用下,araC和araBAD基因大量表达,操纵子充分激活。第85页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四 araC的表达受到自身产物AraC的自动调控。当没有阿拉伯糖时,AraC起着一个转录阻遏物的作用。 细胞中AraC蛋白质稳态水平的测量表明,阻遏araC转录大约需要40个AraC。因此当AraC蛋白水平低时(就是说在细胞刚分裂之后),araC将表达直至存在足够的AraC去阻遏它的转录。2. 阿拉伯糖操纵子的自主调节第86页,共
48、145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四阿拉伯糖的作用象AraC的一个调控器,可将AraC由一个阻遏物转换为一个激活剂。阿拉伯糖与AraC结合似乎改变了AraC同源二聚体化特性和促进了AraC-CAP复合物的形成。在这样的条件下,AraC阿拉伯糖的作用象是一个转录激活剂,这正是CAP-cAMP诱导araB,araA,araD转录所需要的。第87页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四当由于araBAD编码的蛋白质的代谢使得阿拉伯糖水平下降时,AraC又转换成一个阻遏物,同时araBAD转录减少,此时尽管CAP-cAMP复合物仍然存在于细胞中。有趣的是,当葡萄糖和阿
49、拉伯糖都很丰富时,ara操纵子被阻遏,这个结果表明araBAD诱导与AraC-阿拉伯糖和CAP-cAMP复合物都有关。第88页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四第89页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四7.3 trp operon与负调控阻遏系统第90页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四 lac, gal和ara操纵子是编码分解代谢途径酶系的操纵子,负责碳源(例如乳糖和阿拉伯糖等)的分解利用,这些操纵子的表达受相应碳源的诱导。 在细菌中还有负责一些物质合成代谢的操纵子,例如色氨酸操纵子(tryptophan operon, tr
50、p operon)就是负责色氨酸合成的操纵子。第91页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四Trp operon生物细胞中的氨基酸合成, 也受操纵子的调节。细胞需要某种氨基酸时,其基因即表达,不需要时基因关闭,达到经济的原则。第92页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四 由于trp体系参与生物合成而不是降解,它不受葡萄糖或cAMP-CRP的调控。 色氨酸的合成主要分5步完成,有7个基因参与整个合成过程。trpE和trpG编码邻氨基苯甲酸合酶,trpD编码邻氨基苯甲酸磷酸核糖转移酶,trpF编码异构酶,trpC编码吲哚甘油磷酸合酶,trpA和trpB则分别编
51、码色氨酸合酶的和亚基。一、 色氨酸操纵子的结构 第93页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四催化分枝酸转变为色氨酸的酶一、 色氨酸操纵子的结构 特点: (1) trpR和trpABCDE不连锁; (2) 操纵基因在启动子内 (3) 有衰减子(attenuator)/弱化子 (4) 启动子和结构基因不直接相连,二者被前导序列(Leader)所隔开 第94页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四trp operon 的阻遏系统Trp R 四聚体第95页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四阻遏蛋白trp 有活性的阻遏物SNE299trp O
52、不转录第96页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四2 阻遏蛋白的结合位点 trpO -21 +1,反向重复序列trpP -40 +18活性阻遏物与trpO 的结合与RNA pol与启动子的结合发生竞争第97页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四3 阻遏系统主管转录是否启动,低浓度Trp时, mRNA起始合成 粗调开关第98页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四3 阻遏系统在trp mRNA 5 端trpE基因的起始密码前有一个长162bp的mRNA片段,如果其中123150位碱基序列缺失,trp基因表达可提高6-10倍,而且无论是在阻
53、遏细胞内还是在永久性突变的细胞内都一样。当mRNA合成起始以后,除非培养基中完全没有色氨酸,转录总是在这个区域终止,产生一个仅有140个核苷酸的RNA分子,终止trp基因转录。162bp的片段-前导区123150区序列-弱化子终止的转录的调节区域称为弱化子(衰减子)第99页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四1)弱化子: DNA中可导致转录过早终止的一段核甘酸序列(123-150区)。123150第100页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四实验表明弱化作用需要负载tRNATrp参与,意味着前导序列的某些部分被翻译了。分析前导序列发现,它包括起始密码子A
54、UG和终止密码子UGA;如果翻译起始于AUG,应该产生一个含有14个氨基酸的多肽。这个假设的多肽(实际未观察到)称为前导肽。 第101页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四前导序列具有一个非常有意义的特点,在其第10和第11位上有相邻的两个色氨酸密码子。组氨酸操纵子中,也具有弱化子,也具有一个类似的能编码前导肽的碱基序列,此序列中含有7个相邻的组氨酸密码子。苯丙氨酸操纵子中同样存在弱化子结构,其前导序列中也有7个苯丙氨酸密码子。这些密码子参与了trp及其他操纵子的转录弱化机制。第102页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四第103页,共145页,2022
55、年,5月20日,8点18分,星期四POE4321LDNARNAATGTGA2 trp codons1432mRNA前导区的序列分析 trp前导区的碱基序列已经全部测定,引人注目的是其中4个分别以1、2、3和4表示的片段能以两种不同的方式进行碱基配对,有时以1-2和3-4配对,有时只以2-3方式互补配对。RNaseT1降解实验(此酶不能水解配对的RNA)表明,纯化的trp前导序列中确有1-2和3-4的配对方式,由此定位的3-4配对区正好位于终止密码子的识别区,当这个区域发生破坏自我配对的碱基突变时有利于转录的继续进行。第104页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四UUUUUU
56、UU调节区 结构基因 trpROP前导序列 弱化子区域 UUUU前导mRNA1234弱化子结构 第10、11密码子为trp密码子 终止密码子 14aa前导肽编码区: 包含序列1 形成发夹结构能力强弱: 序列1/2序列2/3序列3/4 trp 密码子 UUUU第105页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四Terminator 研究引起终止的mRNA碱基序列,发现该区mRNA通过自我配对可以形成茎-环结构,有典型的终止子特点。第106页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四UUUU34UUUU 334核糖体 前导肽 前导mRNA1.当色氨酸浓度高时 转录衰减机
57、制 125 trp 密码子 弱化子结构就是终止子可使转录前导DNA UUUU 3 RNA聚合酶 终止第107页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四UUUU342423UUUU核糖体 前导肽 前导mRNA 15 trp 密码子 结构基因前导DNA RNA聚合酶 2.当色氨酸浓度低时 Trp合成酶系相关结构基因被转录 序列3、4不能形成弱化子结构 第108页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四弱化子对转录调控的关键空间结构,10th and 11th codons encode the trp residues (rare AA)时间,核糖体停顿在2个Trp
58、 密码子上时,产生延宕(delay ), 此时4区未转录出来The leader peptide is to determiner trp availability and to regulate transcription termination14amino-acid (encoded by 27-68 of the leader RNA summary第109页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四trp Operon: 阻遏作用与弱化作用的协调trp操纵子具有双重调节体系细菌通过弱化作用弥补阻遏作用的不足,因为阻遏作用只能使转录不起始,对于已经起始的转录,只能通过弱化
59、作用使之中途停下来。阻遏作用的信号是细胞内色氨酸的多少;弱化作用的信号则是细胞内载有色氨酸的tRNA的多少。它通过前导肽的翻译来控制转录的进行,在细菌细胞内这两种作用相辅相成,体现着生物体内周密的调控作用。第110页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四Negativerepressible operon可以被最终合成产物所阻遏R P O leading seq. E D C B Atrp+为什么需要阻遏体系? 当大量Trp 存在时,阻遏系统起作用。阻遏物与之结合,阻止先导mRNA合成。 经济第111页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四仅有少量 trp时
60、,RNApol启动R P O leading seq. E D C B A少量trp+不足以结合 O 位点,弱化子不起作用为什么需要弱化系统? 当Trp浓度低时,阻遏物从有活性变为无活性,以保持培养基中适当的Trp水平。第112页,共145页,2022年,5月20日,8点18分,星期四细菌演化出弱化系统的生物学意义 通过tRNA荷载与否进行调控,更为灵敏 氨基酸的主要用途是合成蛋白质,因而tRNA 荷载为标准进行调控更为恰当 两个调控系统,避免浪费提高效率 阻遏系统 高水平trp时,不转录 低水平trp时,转录至满足生长需求 弱化系统 细调 原核生物细致的精细调控机制增强原核生物对环境的适应性
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