贝那普利及其活性代谢物贝那普利拉的衍生化LCMS同时测定课件

1、 人血浆中贝那普利及其活性代谢物贝那普利拉的衍生化LC/MS同时测定法及其药代动力学特征 姓 名：简龙海 导 师：丁 黎 吴如金 方 法 特 点 （1）通过对贝那普利及其活性代谢物贝那普利拉进 行甲酯化，首次建立了衍生化LC/MS法快速、灵敏地同时测定两者的血药浓度； （2）首次研究了贝那普利及其活性代谢物贝那普利拉在国人体内的药代动力学。 第一部分 盐酸贝那普利是第一个可用于治疗肝、肾功能不全高血压患者的血管紧张素转化酶抑制剂 。1990年3月首次在丹麦上市，1999年国家药品监督管理局批准北京诺华制药有限公司生产上市，商品名为洛汀新。 文献报道贝那普利口服后吸收迅速，消除快，其在体内经肝脏

2、水解生成有活性的二元羧酸代谢物贝那普利拉，代谢过程见下图。代谢活性是贝那普利的1000倍 目前对于和血药浓度的测定方法已有文献报道：GC/MS 法同时测定血浆中和的浓度， 但样品需要衍生化以帮助气化，而且血浆处理需要经过一步固相萃取、两步液-液萃取，操作繁琐、耗时，不利于大批量生物样品的分析。另外，固相萃取的回收率低， 和分别为30.5%、62.4%。 目前LC/MS联用技术作为一种新型分离分析技术，在体内药物分析中正发挥着独特的作用。 对于和，目前未见到有文献报道以LC/MS法同时测定其血药浓度。于是我们希望建立LC/MS法同时测定和的血药浓度。 3、以LC/MS法测定时灵敏度不高，达不到该

3、药的药代动力学灵敏度要求，而 的灵敏度较高。 2、的分子结构比的分子结构多1个乙基，少1个羧基，结果和在色谱柱上的保留相差太大，不利于同时测定； 仔细研究和的化学结构式发现，羧基和酯基导致了和在色谱保留和质谱响应上均具有较大的差别，所以需要对羧基进行酯化结构修饰，其中甲酯化是个较理想的方法，因为其有以下四个优点： （1）和甲酯化后，两个衍生物化学结构式之间只相差一个亚甲基，极性相近，有利于同时测定； （2）和甲酯化后，有利于样品的离子化，从而提高灵敏度；衍生化 衍生化试剂选择 衍生化试剂的制备 衍生化反应 衍生化产物的确证 衍生化产物的色谱保留和灵敏度 小结衍生化试剂选择 羧基化合物的甲酯化试

4、剂可采用甲醇制盐酸(硫酸）溶液或重氮甲烷乙醚溶液。甲醇制盐酸(硫酸）溶液的反应时间长，不适于微量合成。重氮甲烷活性强，反应产率高，几乎可达100，反应时间短，对一元酸、二元酸均能有效甲酯化，可用于微量合成， 很适合于血浆中和的甲酯化。甲酯化反应 R-COOH + CH2N2室温R-COOCH3 + N2反应方程式如下：I.S.IDIIIDIIDI.S.甲酯化产物的确证M+H+ M+Na+ M+K+ M+H+ M+Na+ M+H+M+Na+M+H+M+Na+M+H+ M+Na+ M+H+ M+Na+ 另外， 还对衍生化前后主要碎片离子进行比较 ，结果表明甲酯化反应是成功的。 甲酯化衍生物的色谱保

5、留和灵敏度30倍于 II的响应4倍于 I的响应I.S.I.S.IDIIIDII条件的选择 Fragmentor 电压 血浆处理方法 血浆样品的酸碱度 衍生化反应时间 流动相水相的pH值 水相中醋酸铵的浓度 小结Fragmentor 电压的选择 由于质谱仪上的Fragmentor电压会影响到样品在质谱仪上的碰撞诱导解离（CID）效果，从而影响样品各种离子的响应，所以需要选择一个合适的Fragmentor电压和合适的离子，使待测物在质谱仪上有最高的响应。我们在Fragmentor电压分别为50150 V时测定同一个样品。 和极性强，以常规的液-液萃取法处理时回收率极低，而以固相萃取法处理血浆时，文

6、献报道回收率不高，而且操作繁琐、耗时。为了快速、简便地进行血浆样品前处理，我们先是将血浆样品直接与重氮甲烷-乙醚溶液反应、萃取，但结果回收率低、重现性差，原因可能是含有大量羧酸的血浆中蛋白质干扰了和与重氮甲烷的反应。于是我们将血浆去除蛋白后，再进行衍生化反应。 血浆处理方法的选择 然而，去除蛋白的血浆上清液由于含有水，难以全部吹干，而且即使全部吹干，所得的回收率也很低（小于50%）。于是我们只吹去大部分较易吹干的有机层，只剩余约0.5 ml难于吹干的水层，再与重氮甲烷-乙醚溶液进行反应。结果回收率得到了提高，重现性也满足生物样本分析要求。 由于蛋白沉淀试剂不同，空白血浆的干扰情况、样品的回收率

7、都会不同，所以需要选择一个适当的蛋白沉淀试剂。 三种血浆处理方法均无内源性物质干扰样品的测定，而且以乙醇处理的样品响应最高。血浆样品酸碱度的选择 以乙醇沉淀蛋白时，上清液的pH为 910。在这个pH范围内，、及内标三者的羧基会部分解离成阴离子状态，从而不利于它们的衍生化。于是我们对血浆样品最适pH值进行选择。衍生化反应时间的选择 反应时间分别为3、5、10、20 min ; 浓度均为400 ngml-1 。流动相水相pH的选择 水相的pH值会影响到样品的离子化效果。pH分别为6.5、5.9、5.3、4.8、4.0、3.5、3.0水相中醋酸铵浓度的选择 醋酸铵浓度的高低有时会影响到质谱响应的强弱

8、。小结血浆的处理：血浆样品加入内标后，以50 l 0.1molL-1盐酸酸化后，加入乙醇沉淀蛋白后，取上清液以氮气流吹至残余0.5 ml左右的溶液。加入重氮甲烷乙醚反应5 min。取上清液以氮气流吹干。残渣溶解，离心，取上清液进行LC/MS分析。流动相：水（以冰醋酸调pH 至5.3） -甲醇（15:85，v/v）；流速：1.0 mlmin-1；色谱柱：Lichrospher ODS（dp 5 , 250 mm4.6 mm ID ）。质谱条件：仪器：Agilent 1100 LC/MSD；工作站：Agilent ChemStations；离子检测方式：SIM ；离子极性：Positive ；离子

9、化方式：气动辅助电喷雾离子化；Fragmentor电压：100 V；检测对象： M+H+ 离子，m/z 439.3，m/z 425.3，m/z 391.3；毛细管电压：4000 V；干燥气流速：10 Lmin-1；干燥气温度：350；雾化气压力：40 psig 。DI.S.DIIDI方法学考察DI.S.DIIDI 和的标准曲线分别在0.990396 ngml-1 、0.993397 ngml-1 范围内线性良好，相关系数 r 0.99。 LLOQ分别为0.990、0.993 ngml-1 。方法学小结与讨论 所建立的方法符合生物样品分析要求。 灵敏度比文献报道的高。 贝那普利回收率约是文献报道的3倍；贝那普利拉的回收率虽然不高，但结果可重现且灵敏度高。Benazepril和在人体中的药代动力学及其生物等效性研究Benazeprilat单剂量服用10 mgHCl后的的药代动力学参