浮萍rbcS启动子介导的组织特性研究

1、编号2014140132研究类型基础研究分类号Q7生物学综合实验Comprehensive Experiment of Biology论文题目浮萍rbcS启动子组织特性研究作者姓名学号所在院系生命科学学院学科专业名称生物科学导师及职称王XX 副教授论文完成时间2014年3月25日浮萍rbcS启动子介导的组织特性研究1,王XX*（1,湖北师范学院生命科学学院1103班；湖北，黄石435000 ，*湖北师范学院生命科学学院，湖北，黄石435000. 通讯作者）Study on the Tissue Characterization of Duckweed rbcS Promoter1，WANG X

2、X *(1, College of Life Sciences , Hubei Normal University,Huangshi, Hubei , 435000*College of Life Sciences , Hubei Normal University, Huangshi, Hubei , 435000)Abstract SSU5C promoter , a new rbcS promoter, was cloned from Lemna minor. SSU5C promoter was fused to the GUS reporter gene to construct a

3、 plant binary vector (p1438-IGUS), and introduced into duckweed by agrogacterium-mediated transformation, so that regenerated plantlets were retained. This study was focused on the tissue characterizaition of SSU5C promoter.The results of GUSs Test show that SSU5C promote drove GUS to express in the

4、 green tissue like leaf, stem and petiole, whereas no GUS activity was observed in root. The SSU5C promoter has chloroplasts dependencies.Keywords Lemna gibba, SSU5C promoter，RbcS promoter，GUS gene，Tissue Characterization摘 要SSU5C启动子是从浮萍基因组中新克隆的一个rbcS启动子。将SSU5C启动子与GUS基因融合，构建成植物双元表达载体p1438-IGUS，利用农杆菌介

5、导法转化烟草，获得转基因植株，研究SSU5C启动子在烟草中的组织特异性表达。GUS检测结果表明：SSU5C启动子主要驱动GUS基因在烟草叶片和叶柄等绿色组织中表达，而在根部不表，SSU5C启动子具有叶绿体依赖性。关键词 浮萍，SSU5C启动子，rbcS启动子，GUS基因，组织特异性中图法分类号 Q7 浮萍(Lemna gibba)为单子叶植物，属浮萍科浮萍属。它是最小的有花植物之一，无茎叶之分，统称叶状体(fronds)。浮萍rbcS（(ribulose-1, 5-bisphosphate carboxylase small subunit)）启动子是1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶（Rubi

6、sco）的小亚基基因的启动子，1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶(Rubisco)存在于所有高等植物和自养细菌中，是所有光合生物进行光合碳同化的关键酶(Miziorko和Lorimer1983)，也是光合植物叶片中含量最丰富的蛋白质，约占可溶性总蛋白的50%，因此，利用它所编码的基因的高表达特性来启动外源目的基因在转基因浮萍中高效表达是一种非常有效的手段1。近年来，组成型启动子如CaMV 35S 启动子和Ubiquitin启动子等广泛应用于转基因植物外源基因的表达(Bhullar et al., 2007)。组织特异启动子，其作为一类专一性启动子，能启动外源基因在植物发育过程中某一特定时空的表达

7、，也能使目的基因的表达产物在一定空间积累，增加区域表达量2。从浮萍基因组中克隆了具有自主知识产权、长度为1491bp 的一个新的rbcS基因启动子（命名为SSU5C 启动子）。SSU5C 启动子是一个组织特异性诱导性启动子。该启动子可驱动GUS 基因在烟草特定组织中表达2。本文中，从浮萍基因组中新克隆出一个rbcS基因的5上游调控区序列SSU5C启动子，构建了由该调控序列控制的GUS融合基因，并将此融合基因导入烟草中；研究结果证实浮萍rbcS启动子在启动外源基因的表达上表现出明显的组织特异性。1.材料与方法1.1材料转基因烟草p1438-IGUS，NF ，NF（终浓度1 M ）的0.5MS液体

8、培养基，GUS染色液。1.2方法1.2.1SSU5C启动子在烟草营养器官中的表达（1）取培养至1-2月的35S-IGUS, pSSU5C-IGUS , C2IG烟草幼苗整株，置于无菌水中冲洗数次。将整株烟草置于GUS染色液中37 染色24-48 h。（2）叶绿体脱色液中脱色1 h后，更换脱色液再次脱色1-2 h。（3）观察GUS基因在烟草中的表达特点。（4）其中pSSU5C-IGUS烟草幼苗是实验组，35S-IGUS , C2IG烟草幼苗分别作为阳性对照和阴性对照。2.结果与分析2.1烟草GUS染色分析为了研究浮萍SSU5C启动子介导的GUS表达的组织和器官特性，将1-2月龄T1烟草p1438

9、-IGUS幼苗组织化学染色，其中烟草35S-IGUS作为阳性对照，其含有组成型启动子，烟草C2IG作为阴性对照，其不含启动子，GUS基因不能表达。图1A中的整个植株均被染成蓝色，图1C中整个植株均无蓝色，图1B中的植物只有叶片和叶柄呈现蓝色。结果证实，GUS基因在烟草35S-IGUS中是组成型表达，而在烟草p1438-IGUS叶片和叶柄中特异表达，在烟草C2IG中不表达（图1）。 A. 35S-IGUS B .p1438-IGUS C.C2IG图1 12月龄T1烟草p1438-IGUS幼苗的GUS染色分析2.2结果分析出现图1A的现象是因为烟草35S-IGUS含有组成型启动子，该组成型表达的启

10、动子驱动转基因植株所有部位的GUS基因表达，GUS基因的表达产物与GUS染液反应后呈现蓝色，所以图1A整个植株均呈蓝色；图1C中的烟草C2IG不含启动子，GUS基因在该植株中不表达，所以，图1C中整个植株不出现蓝色；图2B中，只有转基因植株的叶片和叶柄呈现蓝色，而植株的茎和根部不呈现蓝色，这说明，在转基因烟草p1438-IGUS的叶片和叶柄中，SSU5C启动子驱动了GUS基因的表达，而在其茎和根部，SSU5C启动子未驱动GUS基因的表达。实验结果证实，GUS基因在烟草35S-IGUS中是组成型表达，而在烟草p1438-IGUS叶片和叶柄中特异表达，在烟草C2IG中不表达，即SSU5C启动子具有组织特异性。众所周知，植物的叶片和叶柄与植物的茎和根部相比较，前者（叶片、叶柄）含有很多的叶绿体，而后者不具有叶绿体或叶绿体含量很少，因此，可以推断出结论：SSU5C启动子具有叶绿体依赖性。3.讨论本研究将从浮萍基因组中新克隆的一个rbcS启动子SSU5C启动子与GUS报告基因融合，并导入烟草中，以详细了解其表达特性。结果表明所克隆的浮萍rbcS启动子在驱动外源基因的表达上表现出明显的组织特异性，SSU5C启动子主要驱动GUS基因在烟草叶片和叶柄等绿色