毕业论文-双乳液法制备功能化的环糊精纳米粒子

1、金陵科技学院学生学位论文 毕 业 设 计（论 文） 设计(论文)题目： 双乳液法制备功能化的环糊精纳米粒子 学生姓名： 指导教师： 二级学院： 材料工程学院 专业： 材料科学与工程 班级: 12材料科学与工程 学 号： 提交日期: 2016 年 5月22日 答辩日期： 2016年5月17日 金陵科技学院学士学位论文 目录 绪 论1.1 聚合物纳米粒子的简介纳米技术1是近年来出现的一门新兴技术，是研究结构尺寸在1100nm范围内的物质的运动规律和性质的科学技术。纳米材料有很多独特的性能，比如小尺寸效应、宏观量子隧道效应及表面和界面效应等，受到人们的广泛关注。纳米粒子是纳米技术在生物医用领域的应用

2、，是纳米科学技术领域的一个重要的研究方向。纳米粒子包括微粒、纳米球、脂质体、纳米囊等。根据制备纳米粒子所用的材料的来源，可以将纳米粒子分为聚合物纳米粒子、无机纳米粒子和生物活性结构纳米粒子等2。其中，聚合物纳米粒子是研究最广泛的一类纳米粒子,尺寸通常为101000 nm。根据相关研究，目前为止，用于药物传输的纳米材料主要是以聚合物为主体。药物既可以通过物理包埋，又可以通过化学键接的方式结合到聚合物纳米粒子中3。聚合物可以使天然高分子和合成高分子，用于制备纳米粒子的聚合物也是如此。一些可生物降解的合成高分子材料因具有良好的生物相容性而被广泛使用。可生物降解高分子材料制备成纳米粒子可以携带多种治疗

3、药物,包括亲水性药物、亲脂性药物、生物大分子等,还可能作为疾病治疗的药物载体，靶向传输药物到病灶处4。药物在体内能够持续稳定释放,并且载体可生物降解，所以不会在体内蓄积。与普通制剂相比，用于药物传递的聚合物纳米粒子5有以下优点：尺寸小，有利于将药物带入细胞内，提高药效；聚合物的分子量较大，因而用聚合物作为药物载体时可以延长其在病灶部位的停留时间。药物包封在聚合物内部，还起到了保护作用，防止药物被提前代谢；聚合物可以进行表面修饰，从而具备靶向性或刺激响应性，能够达到靶向治疗和控制释放药物等目的；聚合物降解后释放药物，不会再体内蓄积。1.2 聚合物纳米粒子的制备方法材料、药物的性质不同，纳米粒子的

4、制备方法也有所不同，迄今为止所采用的制备聚合物纳米粒子的方法主要有乳化溶剂挥发法、溶剂扩散法、盐析法和单体聚合法等。1.2.1 乳化溶剂挥发法溶剂挥发法是制备纳米粒子最常用的方法之一，乳化溶剂挥发法分为单乳液法和双乳液法，最本质的区别在于单乳液法所载药物为油溶性药物，双乳液法可以载水溶性药物。单乳液法：将聚合物溶解于有机溶液中形成油相，然后将其加入到含有乳化剂、保护胶体的水溶液中,通过高速乳化、超声分离等方法直接分散有机相,形成水包油乳液,粒子中的有机溶剂挥发后即可得聚合物纳米载药粒子。超声或者搅拌设备会影响有机相分散的效率，最终影响粒子的尺寸。双乳液法：这种制备聚合物粒子的方法是由单乳液法进

5、一步发展得到的，将聚合物溶解于有机溶液中形成油相，水溶性药物或生物大分子加入到水相中，通过超声细胞粉碎进行乳化，形成油包水乳液，随后将其加入到含有乳化剂、保护胶体的水溶液中，通告超声细胞粉碎再次乳化，形成水包油包水乳液，最后利用持续搅拌，保证乳液的稳定以及促进溶剂挥发，从而固化形成聚合物微/纳米粒子。乳化溶剂挥发法中对于溶剂的要求是，有机溶剂对聚合物以及药物的溶解性强，在水中的溶解度小，几乎不溶于水，二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯为常用的有机溶剂，聚乙烯醇和明胶是常用的乳化剂。 Julienne等6的研究表明,在乳化挥发过程中7,乳化剂的类型、浓度及水相与油相的体积比直接影响粒子的粒径及粒径分布范围

6、。研究发现,有机相的浓度较低时,粒子尺寸较小,粒度分布窄,尺寸均一。聚合物分子量高，溶液黏度大,不利于液滴的分散,制得的粒子较大。最近的研究显示，对于加入PVA乳化剂制备得到的聚合物粒子，粒子表面的分散剂无法通过洗涤和纯化除尽，且在分散剂容易与环糊精衍生物发生粘粘，使得在洗涤过程中损失了大量的纳米粒子。此外，当分散剂无法完全除去时，粒子的表面特性以及对药物的控释能力都会受残余在粒子表面的分散剂影响。1.2.2 溶剂扩散法将药物溶于含部分水溶性有机溶剂的不溶于水的有机溶剂中形成水油混合相，油相中的水溶性有机溶剂会自动向水相中扩散,在两相界面形成湍流，降低表面张力，使液滴不断变小，进而形成载药的纳

7、米粒子。这种方法适用于脂溶性药物。1.2.3 盐析法盐析剂能够将有机溶剂从水溶液中分离出来，盐析法就是将聚合物和药物溶解在丙酮中,均质化之后加入到含有分散剂和盐析剂的水溶液中,形成水包油乳液,然后用大量的水稀释该乳液,使丙酮扩散到水相后,即形成了载药聚合物纳米球。1.2.4 单体聚合法8通过单体聚合反应也可以制备载药纳米粒子。主要采用乳化聚合法和界面缩聚法。在乳化聚合法中,表面活性剂形成胶束，引发剂引发单体在胶束表面进行聚合反应，最后加入终止剂终止聚合反应即可得纳米粒子。这种方法最大的优点是没有引入有机溶剂。界面聚合法是将两不相溶的液体混合，反应在两相界面进行，具体地讲就是将单体溶于醇，药物溶

8、于有机溶剂，混合注入水中。醇溶液是水相，有机溶液时油相，醇从油相扩散进入水相的过程中,降低了表面张力，高速剪切后形成油性小液滴。单体因具有两亲性滞留在两相界面,同时进行聚合反应。1.3 基于环糊精的智能响应型聚合物纳米粒子用于制备纳米粒子的理想的载体材料应具有良好的生物相容性,并且不与药物发生化学反应而失去药效。载体材料需有一定的强度,与药物结合后稳定,同时给药后能以一定的速度释药。环糊精（CDs）9是由D-吡喃葡萄糖单元通过-1,4-糖苷键首尾连接而成的大环分子，自1891年被Villiers发现之后成为各个领域的研究热点10-18,如图1所示。其中，-，-，-环糊精是最常见的,他们分别由6

9、,7,8个葡萄糖单元构成。环糊精截面为锥形状，拥有中空的结构，如图2所示，锥形腔深约0.79nm，上下两端直径随着葡萄糖单元的增多而增大。锥腔外存在大量的羟基而呈亲水性，锥腔内呈疏水性。这种疏水的空腔利用疏水作用力、氢键和范德华力等进行分子识别，能与许多带有疏水基团的化合物形成主客体包合物。环糊精不可避免的存在一些局限性，比如未经修饰的环糊精在水中溶解性较差，缺乏生物酶分子的有效功能位点等，限制了它在水相中的进一步应用。因此人们对环糊精进行适当必要的化学修饰使环糊精主体功能化，很好地扩展了它的应用。 图1.1 -环糊精立体结构图和环糊精结构特征示意图通过带电基团、亲水基、疏水基或者亲疏水单元结

10、构性改装环糊精，从而增强它的物理化学性能和分子识别能力。而且，环糊精可以连接到不同结构的聚合物上，使材料具有独特的性能和良好的生物相容性。环糊精及其衍生物由于其良好的生物相容性，在制备治疗性纳米粒子方面极具吸引力。刺激响应性纳米粒子已被认为是最具发展前景的药物载体。它可以通过在特定位置释放药物，触发疾病相关的病理生理信号后释放药物，通过特定的传送途径释放药物，从而提高治疗效果，减少副作用。环糊精及其衍生物是最流行的有机材料之一，被用于制备响应性纳米载体。查阅相关文献可知，利用缩醛化试剂2-甲氧基丙烯与环糊精反应，二甲基亚砜为溶剂，吡啶对甲苯磺酸盐为催化剂，在氮气的保护下，恒温磁力搅拌若干小时后

11、向该体系中加入三乙胺终止反应，碱性水中沉淀并过滤，最终可以得到具有pH敏感的环糊精衍生物。合成环糊精衍生物过程结构示意图如下：图1.2 环糊精衍生物合成示意图其中，2-甲氧基丙烯（MPP）是缩醛化反应的重要原料，英文名称2-methoxypropene，其分子式为C4H8O，无色透明液体，有特殊的气味，不溶于水，与甲醇、丙酮等互溶，在酸性条件下，易与醇等进行反应。 这种pH敏感的环糊精可以利用其空腔实现对药物的包合作用，在酸性条件下将药物释放出来，以此为基础制备的纳米粒子不仅具备pH敏感的环糊精固有的特点，还具有纳米粒子作为药物载体的优点，比如尺寸小，易穿透细胞的特点，可以靶向释放药物，实现药

12、物控释19等。1.4 本论文研究思路和主要内容 本论文的核心内容是用双乳液法制备功能化环糊精的纳米粒子，并对其制备工艺进行优化，从而获得尺寸分布均匀，形状规则的纳米粒子。选取最优的方案，以双键化明胶这种生物大分子和左氧氟沙星为模拟药物，测试载药纳米粒子的药物包封率和体外药物释放行为。以双键化明胶中的双键为着手点，进行自由基聚合，目的在于在纳米粒子中填充一定数量的凝胶，对这种两相结构进行表征，进一步扩大纳米粒子的应用范围。金陵科技学院学士学位论文 第2章 双乳液法制备功能化环糊精纳米粒子2 双乳液法制备功能化环糊精纳米粒子2.1 前言众所周知，环糊精及其衍生物有良好的生物相容性和包容性，这些特点

13、使得他们在开发治疗性纳米粒子方面极具吸引力。载药纳米粒子20是纳米技术与现代医药学结合的产品。纳米粒子是一种超微小球型药物载体，是近年来出现的药物控释和缓释的新剂型，它的突出优点是比细胞还小（10-1000nm之间），因此可被组织及细胞吸收，甚至经特殊加工后可对组织或器官定向给药。乳化-溶剂挥发法是制备聚合物纳米粒子的众多方法中最常用的一种。其制备的一般过程是：利用乳化的方法将溶液中有聚合物的有机相分散到含有分散剂或者乳化剂的连续相中形成乳液，待乳液液滴中的有机溶剂挥发后，得到固化的聚合物粒子的一种方法。根据所用连续相类型的不同，这种方法分成水相和油相两种，当水相为连续相时，又可分为单乳液与双

14、乳液乳化-溶剂挥发法两类。 本论文旨在阐述双乳液法制备的纳米粒子。在制备过程中，使用的溶剂、环境的温度、稳定剂的种类以及搅拌速率最终均会影响制备得到的粒子的各方面性能。本章将着重讨论PVA浓度和水油比对纳米粒子尺寸和形貌的影响。2.2 实验部分2.2.1 实验试剂及仪器表2.1 实验所用原料规格及生产厂家试剂规格厂家二氯甲烷分析纯（AR）上海中试化工总公司聚乙烯醇分析纯上海影佳实业发展有限公司氯化钠分析纯国药集团化学试剂有限公司氯化钾分析纯南京化学试剂有限公司十二水合磷酸氢二钠分析纯南京化学试剂有限公司磷酸氢二钾分析纯国药集团化学试剂有限公司二氯甲烷分析纯（AR）上海中试化工总公司聚乙烯醇分析

15、纯上海影佳实业发展有限公司实验中所配的溶液均以PBS缓冲液（pH=7.4）为溶剂，所用试剂包括实验室制备的双键化明胶和pH敏感的-环糊精。表2.2 实验中所用的主要设备仪器名称仪器型号生产厂家电子天平MA110上海越平科学仪器有限公司电热鼓风干燥箱101-1A天津市泰斯特仪器有限公司紫外可见分光光度计Evolution200赛默飞世尔（上海）科技有限公司 粒度电位仪Nano-ZS马尔文仪器公司冷冻干燥机FD-1-50北京博医康实验仪器有限公司超声细胞粉碎机JY92-IIDN宁波新芝生物科技有限公司台式离心机TGL-16C上海安亭科技仪器厂扫描电镜SU8010型HITACHI日立集团2.2.2

16、双乳液法制备功能化环糊精纳米粒子将100mg pH敏感的-CD溶于1mL二氯甲烷中形成溶液1，将10mg双键化明胶溶解于200L PBS缓冲溶液中形成溶液2，然后将溶液2加入溶液1，在冰浴条件下，用超声波细胞粉碎机乳化30秒后，将初乳液倒入6mL 3% PVA溶液中，再超声乳化1分钟，将混合乳液倒入20mL 0.3% PVA溶液中，磁力搅拌6-12小时，离心分离，用碱性水（pH=7.4）水洗5遍后即可得到环糊精衍生物的纳米粒子。其中，pH敏感的-CD溶于二氯甲烷形成油相，PVA溶液为水相1，双键化明胶溶解于PBS缓冲液形成水相2，以下所探讨的水油比即水相1或水相2与油相的体积比。实验方案如下：

17、（1）探索PVA浓度对纳米粒子的影响将100mgpH敏感的-CD溶于1mL二氯甲烷中形成溶液1，将10mg双键化明胶溶解于200L PBS缓冲溶液中形成溶液2，然后将溶液2加入溶液1，在冰浴条件下，用超声细胞粉碎机乳化30秒后，将乳液倒入6mL 1% PVA溶液中，再超声乳化1分钟，将混合乳液倒入20mL 0.3% PVA溶液中，磁力搅拌612小时，离心分离，水洗5遍后即可得到功能化环糊精的纳米粒子。上述制备过程中，其他条件不变，将PVA浓度分别改为3%和1%。上述制备过程中，其他条件不变，将PVA浓度分别改为5%和1.5%。（2）探索水油比对纳米粒子的影响实验方案以实验方案为基础进行的进一步

18、探索，旨在探索水相与油相比例不同对纳米粒子形貌和尺寸的影响,具体方案如下：将100mg pH敏感的-CD溶于1mL二氯甲烷中形成溶液1，将10mg双键化明胶溶解于200L PBS缓冲溶液中形成溶液2，然后将溶液2加入溶液1，在冰浴条件下，用超声细胞粉碎机乳化30秒后，将乳液倒入10mL 1% PVA溶液中，再超声乳化1分钟，将混合乳液倒入20mL 0.3% PVA溶液中，磁力搅拌6-12小时，离心分离，水洗5遍后即可得到功能化环糊精的纳米粒子。将100mg pH敏感的-CD溶于1mL二氯甲烷中形成溶液1，将5mg双键化明胶溶解于100L PBS缓冲溶液中形成溶液2，然后将溶液2加入溶液1，在冰

19、浴条件下，用超声细胞粉碎机乳化30秒后，将乳液倒入6mL 1% PVA溶液中，再超声乳化1分钟，将混合乳液倒入20mL 0.3% PVA溶液中，磁力搅拌6-12小时，离心分离，水洗5遍后即可得到功能化环糊精的纳米粒子。上述制备过程中，其他条件不变， PBS缓冲溶液改为50L。上述制备过程中，其他条件不变， PBS缓冲溶液改为33L。2.2.3 纳米粒子的表征3.2.3.1 粒子表面形貌的观察取实验制备而成的乳液适量，用PBS稀释至适当浓度，吸取少量乳液滴在锡箔纸上，自然晾干。用扫描电子显微镜观察粒子的表面形貌。2.2.3.2 粒子结构的观察取实验所得乳液适量，用透射电子显微镜观察纳米粒子是否存

20、在多孔结构。2.2.3.3 粒径及粒径分布的测定取实验所得乳液适量，用碱性水（pH=7.4）稀释至目视稍微浑浊的浓度，超声（功率为20%）1min使粒子充分分散，用动态光散射测定粒径及粒径分布。2.2.3.4 双键化明胶包封率的测定包封率是指纳米粒子的双键化明胶量与投入制备体系的双键化量之比。通过以下公式进行计算：测定方法为：用酶标仪测定不同浓度的明胶溶液的吸光度，以此作为标准曲线，算出样品中的蛋白质浓度，即纳米粒子中的明胶量。蛋白质浓度与纳米粒子的浓度之比即所求的包封率。2.2.4 体外药物释放行为的测定 将100mg pH敏感的-CD溶于1mL二氯甲烷中形成溶液1，将10mg明胶溶解于20

21、0L PBS缓冲溶液中形成溶液2，溶液2中溶入浓度为20mg/ml左氧氟沙星,然后将溶液2加入溶液1，在冰浴条件下，用超声细胞粉碎机乳化30秒后，将乳液倒入6mL 1% PVA溶液中，再超声乳化1分钟，将混合乳液倒入20mL 0.3% PVA溶液中，磁力搅拌6-12小时，离心分离，水洗5遍后即可得到载药纳米粒子。将制备成的载药纳米粒子冻干6h，取10mg的载药纳米粒子粉末溶解于2ml pH=4.5h的酸性水和PBS中，置于4ml离心管中，将离心管置于37恒温水浴中，定点离心取样用紫外分光光度计测定其吸光度。用紫外分光光度计测定已知浓度的溶解有左氧氟沙星溶液的吸光度，算出标准曲线方程。将载药纳米

22、粒子的吸光度代入标准曲线方程，计算药物释放量。2.3 实验结果与讨论2.3.1 PVA浓度对纳米粒子的影响ba badc dc图2.1 不同PVA浓度的纳米粒子的扫描电镜图图2.2 不同PVA浓度的纳米粒子的粒径分布图图2.1和图2.2分别为原始实验方案、实验方案所制备的纳米粒子的扫描电镜图和粒径分布图。从扫描电镜图中可以看出，以上几个实验方案制备的纳米粒子均已成型，为圆球状，尺寸分布较为均一；从粒径分布图中，可以看出随着PVA浓度的升高，纳米粒子的粒径先减小后增大。不同PVA浓度的纳米粒子的粒径和电位及双键化明胶的包封率如表2.3所示。2.3.2 水油比对纳米粒子的影响ba bacc图2.3

23、 不同水油比的纳米粒子的扫描电镜图图2.3为实验方案制备成的纳米粒子的扫描电镜图，由于实验方案中PBS水相分量太低，在扫描电镜图中未观察到成型的纳米粒子，所以结果中并未给出。从扫描电镜图中可以看出，纳米粒子为圆球状。在制作扫描电镜的样品时，纳米粒子的浓度需要适当把握，滴在锡箔纸上的液体为较淡的乳白色最佳。图2.4 不同外层水油比的纳米粒子的粒径分布图图2.5 不同内层水油比的纳米粒子的粒径分布图图2.4为实验方案和，实验方案制备的纳米粒子的粒径分布图。实验方案和，水相1与油相比例不同，水相1与油相比例越大，粒径分布越宽。实验方案中，水相2与油相比例不同。图2.5中峰的位置几乎重合，说明水相2与

24、油相比例对粒径分布的影响较小。不同水油比的纳米粒子的粒径和电位以及双键化明胶的包封率如表2.3所示。表2.3 不同实验条件下制备的纳米粒子的平均粒径实验条件PVA浓度水相1与油相比水相2与油相比DLS粒径（dnm）SEM粒径(dnm)电位（mv）双键化明胶的包封率（%）1%，0.3%6:11:531320440-10.74.591.8020.303%，1%6:11:51929814-9.3311.51.3600.395%，1.5%6:11:524719460-12.17.331.0920.051%，0.3%10:11:534621928-17.610.21.0320.031%，0.3%6:11

25、:1027610213-149.381.1110.071%，0.3%6:11:2020011018-128.120.9960.041%，0.3%6:11:30192无-16.78.771.0110.04从测试的粒度、粒度分布图和电位可以看出，以上探讨的实验条件对纳米粒子的粒度、粒度分布是有影响的，从实验数据可以初步判断：PVA浓度越大，纳米粒子的粒度先变小后增大，当PVA浓度很大时，由于粘度大，其乳化效果并没有PVA浓度低时的乳化效果好；水相1与油相比例对纳米粒子的粒度影响较小，粒度相差不大；水相2与油相比例对纳米粒子影响是水油比越大，纳米粒子的粒度分布越宽。选取实验方案所得的纳米粒子测试所得

26、的透射电镜图如图2.5所示。图2.5 透射电镜图纳米粒子尺寸分布较均匀，与上面扫描电镜图吻合。2.3.3 体外药物释放行为 根据实验组其他成员测试已知浓度的左氧氟沙星溶液的吸光度，得到的标准曲线方程：Y=60.617X-0.061。以此算出，载药纳米粒子的药物释放量，结果如图2.6所示。图2.6 体外释药曲线从图2.6可以看出，载药纳米粒子在PBS中释放量随时间增大，释放速率较慢，6小时后稳定；载药纳米粒子在酸性水中，3小时内释放达到最高值，此后，由于药物时而进入环糊精的空腔结构内，时而在环糊精外面，测定的药物释放不稳定。也可能由于实验误差，在取样过程中，环糊精带走了部分药物。2.4 本章小结

27、（1）PVA浓度对纳米粒子的尺寸有影响，PVA浓度越大，纳米粒子的粒径先变小后变大。（2）水相1对纳米粒子尺寸的影响较小。（3）水相2对纳米粒子的影响主要在于水油比越大，粒径分布越宽。（4）不同实验方案中，明胶的包封率也有所不同。金陵科技学院学士学位论文 第3章 纳米凝胶/环糊精复合粒子的制备3 纳米凝胶/环糊精纳米复合粒子的制备3.1 前言在给药系统的研究中，纳米凝胶经常被用于药物定向释放。通常情况下，发炎部位或患肿瘤处的温度高于正常组织，而pH低于正常组织。为此，人们研究了响应于环境的给药系统，通过药物载体的环境响应性，提高药效，降低毒副作用，甚至靶向治疗疾病等。上一章所述双乳液法制备的环

28、糊精纳米粒子因环糊精具有pH敏感性，对药物释放领域具有十分重要的意义。由于纳米粒子包埋的是双键化明胶，根据自由基聚合机理，以过硫酸铵（APS）和四甲基乙二胺(TMEDA)为氧化还原引发剂进行自由基聚合，使双键化明胶进行交联，从而在纳米粒子上填充一定量的凝胶，可以进一步扩大它在生物医用领域的应用。本章旨在阐述在纳米凝胶/环糊精纳米复合粒子的制备及其表征。3.2 实验部分3.2.1实验试剂与仪器 表3.1 实验所用原料规格及生产厂家试剂规格厂家二氯甲烷分析纯上海中试化工总公司聚乙烯醇分析纯上海影佳实业发展有限公司氯化钠分析纯国药集团化学试剂有限公司氯化钾分析纯南京化学试剂有限公司十二水合磷酸氢二钠

29、分析纯南京化学试剂有限公司磷酸氢二钾分析纯国药集团化学试剂有限公司过硫酸铵分析纯西陇化工股份有限公司四甲基乙二胺生化试剂国药集团化学试剂有限公司 实验中所配的溶液均以PBS缓冲液（PH=7.4）为溶剂，所用试剂包括实验室制备的双键化明胶和pH敏感的-环糊精。表3.2 实验中所用的主要设备仪器名称仪器型号生产厂家电子天平MA110上海越平科学仪器有限公司电热鼓风干燥箱101-1A天津市泰斯特仪器有限公司紫外可见分光光度计Evolution200赛默飞世尔（上海）科技有限公司粒度电位仪Nano-zs马尔文仪器公司透射电子显微镜Tecnar12荷兰PHILIPS扫描电镜SU8010HITACHI日立

30、集团3.2.2 纳米凝胶/环糊精纳米复合粒子的制备将100mg pH敏感的-CD溶于1mL二氯甲烷中形成溶液1，将10mg双键化明胶溶解于200L PBS缓冲溶液中形成溶液2，然后将溶液2加入溶液1，在冰浴条件下，用超声波细胞粉碎机乳化30秒后，将初乳液倒入6mL 1% PVA溶液中，在初乳液中加入APS和TMEDA,再超声乳化1分钟，将混合乳液倒入20mL 0.3% PVA溶液中，磁力搅拌612小时，离心分离，用碱性水（pH=7.4）水洗5遍后即可得到填充有凝胶的环糊精衍生物的纳米粒子。其中，APS和TMEDA的浓度为10mM。记为实验方案。由于不知道氧化还原引发剂在初乳液中是否能够引发反应

31、，对上述实验进行了补充实验，实验方案如下：将100mg pH敏感的-CD溶于1mL二氯甲烷中形成溶液1，将10mg双键化明胶溶解于200L PBS缓冲溶液中形成溶液2，然后将溶液2加入溶液1，在冰浴条件下，用超声波细胞粉碎机乳化30秒后，将初乳液倒入6mL 1% PVA溶液中，在初乳液中加入APS,再超声乳化1分钟，在20mL 0.3% PVA溶液中加入TMEDA后将混合乳液倒入其中，磁力搅拌6-12小时，离心分离，用碱性水（pH=7.4）水洗5遍后即可得到环糊精衍生物的纳米粒子。其中，APS和TMEDA的浓度为10mM。将上述两个实验方案置于45度条件下，记为实验和。3.2.3 纳米粒子的表

32、征3.2.3.1 粒子表面形貌的观察取乳液聚合后制备而成的纳米粒子乳液适量，用碱性水稀释至肉眼可见淡乳白色，吸取少量乳液滴在锡箔纸上，自然晾干。用扫描电子显微镜观察粒子的表面形貌。3.2.3.2 粒子结构的观察取实验所得乳液适量，用透射电子显微镜观察乳液聚合后的纳米粒子中是否填充有凝胶。3.2.3.3 粒径及粒径分布的测定取实验所得乳液适量，用酸性水稀释至目视稍微浑浊的浓度，超声（功率为20%）1min使粒子充分分散，用动态光散射测定粒径及粒径分布。3.2.3.4 双键化明胶包封率的测定包封率是指粒子中双键化明胶量与投入制备体系的双键化明胶的量之比。通过以下公式进行计算：测定方法为：用酶标仪测

33、定不同浓度的明胶溶液对应的吸光度，作出标准曲线，算出样品中的蛋白质浓度，即纳米粒子中的明胶量。蛋白质浓度与纳米粒子的浓度之比即所求的包封率。3.2.3.5 凝胶存在性的判断通过投射电镜观察是否存在两相结构；将纳米凝胶/环糊精纳米复合粒子冻干6h后溶解于酸性水（pH=5.5）中，用紫外分光光度计测定其透射比，按照上述方法测定酸性水中粒子的粒径及粒径分布。3.3 实验结果与讨论3.3.1 表面形貌与结构分析（1）扫描电镜图ba badc dc图3.1 扫描电镜图如图3.1（a）（b）（c）（d）所示，四种实验方案制备的纳米粒子均已成型。说明四种实验方案均具有可行性。（2）透射电镜图 图3.2 透射

34、电镜图选取实验方案所得纳米粒子测试结果如上图所示，乳液聚合后的纳米粒子均为圆球状，尺寸在200400nm左右，与第二章中为经聚合反应的纳米粒子相比，聚合后的纳米粒子有较为明显的两相结构，说明纳米粒子中填充了一定数量的凝胶。3.3.2 粒度及粒径分布分析 上述四个方案的粒径分布图如图3.3所示图3.3 粒径分布图 从图3.3可以看出，四种实验方案的粒径分布相差不大，所以四种方案都具有可行性。3.3.3 双键化明胶包封率由于实验和的唯一区别是温度不同，又因为四种方案均具有可行性。所以选取实验测试其药物包封率，实验结果如表3.3：表3.3 不同实验方案的药物序号包封率（%）1.21.23.3.4 凝

35、胶存在性分析图3.4 不同方案制备的复合纳米粒子的粒径分布图图3.5 复合纳米粒子溶于酸性水的紫外透光率图将pH敏感的功能化环糊精纳米粒子溶解在酸性水中，溶液透明，说明纳米粒子已经溶解，但是动态光散射法及紫外透光率测试结果表明仍然有纳米级粒子的存在，侧面可以判断出凝胶存在。3.4 本章小结以上四种实验方案都可以制备出纳米粒子，从实验结果可以看出纳米粒子中填充一定数量的凝胶这种两相结构制备成功，在实验过程中，纳米粒子成型后洗涤过程中由于粘度较大，洗涤比上一章中未经聚合的纳米粒子困难很多，这在一定程度上能够说明聚合反应后纳米粒子制备成功。从透射电镜图中可以看出，纳米粒子尺寸较均一，是比较规则的圆球

36、，且有明显的两相结构，这能够充分证明乳液聚合制备功能化纳米粒子实验的成功。从实验所得产品在酸性水中溶解之后测试的粒度分布和透射比也可以从侧面说明凝胶结构存在。金陵科技学院学士学位论文 第4章 全文总结4 全文总结利用乳化溶剂挥发法可以成功制备环糊精纳米粒子，由于药物分水溶性和脂溶性，因此制备方法有所不同。乳化溶剂挥发法分为单乳液法和双乳液法，单乳液法制备的载药纳米粒子中药物是脂溶性的，而双乳液法可以载水溶性药物。本文主要阐述了双乳液法制备功能化环糊精纳米粒子，通过调节乳化剂浓度和水油比来调控纳米粒子的粒径以及对生物大分子的包封率。这种pH敏感的环糊精纳米粒子对于药物定向释放具有十分重要的意义。

37、体外药物释放行为测试结果表明，这种纳米粒子在PBS缓冲溶液中释放量很少，在酸性水中释放。此外，为了进一步利用这种纳米粒子结构的优点，结合纳米凝胶在生物领域的应用，本文阐述了通过原位自由基聚合的方法在纳米粒子上填充凝胶。将上述两部分实验相结合，纳米凝胶/环糊精复合粒子可以通过自由基聚合和乳化溶剂挥发法制备，复合粒子的粒径也可以通过调节乳化剂浓度和水油比等来实现。金陵科技学院学士学位论文 参考文献参考文献1 郑明彬, 赵鹏飞, 罗震宇等. 纳米技术在癌症诊疗一体化中的应用J. 科学通报, 2014, 31: 3009-3024.2 尚青, 郑和堂, 闫丽等. 聚合物纳米粒子载药体系的研究进展J.

38、河北工业科技, 2005, 01: 38-43.3 王磊, 徐汉虹, 张志祥. 可生物降解的天然高分子材料应用于农药的研究现状与展望 J. 植物保护, 2009, 05: 6-9.4 刘玉梅. 长春碱纳米粒的制备及其抗肿瘤作用的实验研究D. 西北农林科技大学, 2009.5 查刘生, 高海峰, 杨武利等. 聚合物纳米粒子用于给药载体J. 高分子通报, 2002, 03: 24-32. 6 Juloenne Mc, Alonso M J, et al. Preparation on Poly(DL-Lactide/glycolide) nanoparticles of controlled pa

39、rticle size distribution: application of experimental designsJ. Drug Development and Industrial Pharmacy, 1992, 18: 1063-1077.7 张蜜. 用于无针注射疫苗的纳米载药系统的初步研究D. 华中科技大学, 2008.8 殷亚星,解菊,刁国旺. 环糊精及其衍生物包合作用的理论研究进展J. 化学通报, 2009, 04: 320-325.9 何朝辉. 聚乳酸纳米粒子载药系统的构建及其体外药物释放行为研究D. 中国协和 医科大学, 2007.10 S. Li, W.C. Purdy

40、, Cyclodextrins and their applications in analytical chemistryJ, Chemical Reviews, 1992, 92: 4571470.11 W. Saenger, Cyclodextrin inclusion compounds in research and industryJ, Angewandte Chemie International Edition, 1980, 19: 344362.12 R. Villalonga, R. Cao, A. Fragoso, Supramolecular chemistry of cyclodextrins in enzyme technologyJ, Che