甲胎蛋白基因的检测课件

1、甲胎蛋白基因的检测outline实验目的目的：通过提取肝癌病人的外周血，根据mRNA丰度的测定方法，从转录水平对AFP（甲胎蛋白）基因的表达进行检测。取材：肝癌患者外周血，用健康志愿者与非癌性肝病患者作为对照组。实验方法及原理通过细胞RNA提取技术，然后通过逆转录合成cDNA，利用qPCR技术，测定AFPmRNA的丰度。实时荧光定量PCR（QuantitativeReal-timePCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。Real-timePCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模

2、板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，通过内参或者外参法可对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析。技术路线RNA提取1.细胞或组织加 Trizol后，室温放置5min，使其充分裂解。注：此时可放入-70长期保持。2.12,000rpm离心5min，弃沉淀。3.按200ul氯仿/ml Trizol加入氯仿，振荡混匀后室温放置15min。注：禁用漩涡振荡器，以免基因组DNA断裂。4.412,000rpm离心15min。5.吸取上层水相，至另一离心管中。注：千万不要吸取中间界面；若同时提取DNA和蛋白质，则保留下层酚相存于4冰箱,若只提RNA，则弃下层酚相。带手套是必须的，手是RNase的主

3、要来源！RNA提取6.按0.5ml异丙醇/ml Trizol加入异丙醇混匀，室温放置5-10min。7.412,000rpm离心10min，弃上清，RNA沉于管底。8.按1ml75%乙醇/ml Trizol加入75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。9.4 8,000rpm离心5min，尽量弃上清。10.室温晾干或真空干燥5-10min。RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解。11.可用50ul H2O，TE buffer或0.5%SDS溶解RNA样品，55-60,5-10min。cDNA合成cDNA合成使用Promega逆转录试剂盒反应管中加入1ug总RNA和0.5ug oligodT,70预变

4、性5min,迅速置冰上冷却加入5RTbuffer250mM Tris-HCL(PH8.3),375mM KCl,15mM MgCl2,50mM DTT4ul,10mM dNT1ul,RNA酶抑制剂25U,M-MLV逆转录酶200U,加0.1%DEPC水至总体积20ul,37水浴60min953min灭活逆转录酶,-20冻存备用。RT-PCR上游引物序列:5-TGGGACCCGAACTTTCCAAG-3下游引物序列:5-CCTGCAGACAATCCAGCACAT-3探针序列：5-TGTCCCTCTTCAGCAAAGCAGACT-3RT-PCR50ul PCR反应体系中,包括5PCR buffer 10ul,AFP上下游引物各16pmol,荧光探针10pmol,Tag酶3U,10mM dNTP1ul,cDNA 5ul在ABIPRISM7700型PCR仪(美国PE公司)进行扩增。反应条件:93预变性2min,9345s,55120s,共40个循环。反应结束后由计算机自动得出每ug总RNA中AFP mRNA的拷贝数。可能的结果分析肝癌患者与对照组的外周血中AFPmRNA的表达水平有显著差异。应用AFPmRNA由有活性的肝癌细胞表达,坏死后脱落入血的肝癌细胞不可能有mRNA的表达,即使肝脏癌组织直接释放少量裸露的AFPm