细胞系的建立及鉴定课件

1、 细胞系的建立及鉴定 2012.2.28细胞系：有限细胞系，人的正常组织多数可以建立有限细胞系。如间充质来源的成纤维细胞，牙髓细胞、牙髓干细胞、牙周膜细胞等无限细胞系，永生化细胞系，肿瘤细胞系细胞系/细胞的鉴定细胞系的建立：1.组织块方法2.单层细胞法 原代培养 传代培养 大量扩增细胞后用于实验研究 使用前对细胞的组织特异性进行鉴定成骨细胞：没有唯一的特异性标志物 需数个指标联合证实表面标志：表达ALP。 Gomarri 法合成型胶原、型胶原、骨钙素、骨粘蛋白、骨桥蛋白等骨基质蛋白。组织功能： 体外形成矿化结节。 von Kossa染色法体内成骨。免疫缺陷鼠皮下移植。破骨细胞：唯一特异性标志物

2、破骨细胞含有丰富的酸性磷酸酶和抗酒石酸磷酸酶（tartrat resisitant acid phosphatase,TRAP），TRAP染色阳性是破骨细胞的重要标识。另外破骨细胞表面有降钙素（calcitonin）受体，也可以作为标志物。形态学：多核细胞牙周膜干细胞：干细胞表面标记物:多潜能功能组织细胞分化及功能鉴定 分化为脂肪细胞： 油红O 染色阳性肿瘤细胞系的生物学鉴定 肿瘤细胞系建立后,要对其生物学性状进行鉴定,以便日后的研究有可比较的科学依据肿瘤细胞的生物学特征干系细胞：每个肿瘤内都含有一个或几个具有相对稳定特性的自我保持的（Selfmaintaining）细胞系。肿瘤的生长就是这些

3、细胞系的增殖；非干系细胞：除了干系瘤细胞，肿瘤还具有失去自我保持能力的细胞的后代，可称为“肿瘤的非干系细胞”。动物肿瘤移植实验证实，肿瘤结节在新宿主身上多次传代之后仍具有原来肿瘤的主要特征，包括形态、生化、抗原及细胞遗传的标志。所有恶性肿瘤的转移瘤结节的细胞都具有与亲代原发病损类似的形态学及生物学性质。 培养中的肿瘤细胞特性 1致瘤性： 培养的肿瘤细胞移植到敏感动物后，可获得形成肿瘤的能力。证明细胞在体外能经过类似于体内肿瘤发生过程中出现的变化。 动物接种形成的肿瘤应进行组织学、染色体及其它生物学标志的检查并与原接种细胞进行比较。 致瘤性的判断移植瘤是判断细胞性质的关键步骤。首先，移植瘤的组织

4、形态应与原肿瘤组织一致。但有例外，细胞群体的性质可以与植入前不同，因为在植入的细胞中，只有特殊变异的细胞具有致瘤性，这些变种可能原来就存在于植入群体内，也可能是植入后产生的。在这种情况下可以确认接种的致瘤性。 （2）植入部位 ，例如，将瘤细胞接种到小鼠躯干接近头部位置的皮下，生瘤的阳性率及生长的速度比植到尾部高24倍。（3）植入部位微环境的潜在因素，某些细胞只有在植入部位找到最佳的微环境时才形成肿瘤。生瘤性与细胞其它性质的关系细胞在基质上铺展的面积与生瘤性有关。微丝束的结构破坏。许多生瘤细胞系均有大量的微丝束变化，它与形态转化有关。停泊依赖性与生瘤性联系最密切。 在动物体内不形成肿瘤的细胞系，

5、在半固体培养基内形成集落的能力也低；与之相反，而大多数能在动物体内生瘤的细胞系，形成集落的效率也高。丧失生长抑制性当培养细胞所需任何一种关键性营养物质或生长因子降到阈值以下时,正常细胞的生长即受到抑制,如异亮氨酸,磷酸盐,上皮生长因子等。转化的细胞对一些生长因子需求降低,或失去了对激素和生长因子的需求，在营养不足的情况下可继续生长,它们甚至可以杀死一些自身的细胞,以便在不可能生存的环境下继续生长。或者由于某些转化产生了生长因子类似物,为自身提供了生长因子。 密度依赖性抑制 正常贴壁性细胞的增殖率,随着每单位基质面积内的细胞群体的局部密度增加而下降。这一现象称为密度依赖性抑制(density d

6、ependent inhibition) 。或生长接触抑制(contact inhibition of growth),但二者并不等同。当一个对密度依赖性抑制敏感的培养细胞达到某种密度，即所谓饱和密度时便停止生长。此时细胞停止增殖，但并不死亡。这种抑制可以由于液体培养基中的营养物质耗尽,生长抑制物质的累积所引起。恶性转化细胞对密度依赖性抑制的敏感性在肿瘤演化的过程中自动丢失。 3获得永生性 正常细胞原代培养物经过数次传代就逐渐停止增殖。在肿瘤性演化过程中，细胞可能获得生长无限代数的能力。永生性是肿瘤演化的一个特征。 成纤维及上皮细胞的原代培养经过初期的适应培养条件之后，便进入较稳定的生长时期，

7、生长速度逐渐下降，进入退化期即衰老期。细胞系的寿命差别很大，取决于培养细胞来自的动物种属。 肿瘤细胞系的一般生物学性状: 培养细胞的形态和/或超微结构细胞生长及增殖能力的检测: 细胞生长曲线； 细胞分裂指数； 细胞倍增时间； 细胞周期,DNA合成； 遗传性状检测： 染色体分析:倍体性、染色体众数、核型分析； 同工酶； 集落形成能力； 肿瘤细胞系的特征：特殊标记、癌基因、抑癌基因的表达、病毒感染等； 以上各项指标中异种体内移植致瘤性最为主要,如果一个细胞系接种到免疫缺陷动物体内的适当部位后不能生瘤,则不能证明其具有肿瘤细胞的特征。 细胞悬液的制备要求：5个浓度的细胞悬液分别是： 10000个；8000个；6000个；4000 个；2000个/100ul/孔 每个浓度3个复孔1.细胞悬液的计数 得到1X105个/ml2.确定各实验浓度所需的细胞悬液总量 要求：100ul/孔X（3孔+2孔）500ul3.计算各浓度细胞悬液所需的细胞数 104/孔/100ulX5孔5X