土壤酶活活性测定方法

1、土壤脲酶（urease）活性的测定方法：靛酚比色法（一）方法原理土壤中脲酶活性的测定是以尿素为基质，酶促水解生成的氨与酚类化合物起 反应生成蓝色的靛酚，颜色深度与氨含量相关，因而用于脲酶活性的测定。（二）试剂1）甲苯2）10%尿素：称取10g尿素，用水溶至100mL。3）柠檬酸盐缓冲液（PH6.7）：184克和147.5克氢氧化钾溶于蒸馏水。将 两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至6.7，用水稀释至1000毫升。4）苯酚钠溶液（1.35mol/L）： 62.5克苯酚溶于少量乙醇，加2毫升甲醇和 18.5毫升丙酮，用乙醇稀释至100毫升（A），存于冰箱中；27克NaOH溶于 100毫升水

2、（B）。将A、B溶液保存在冰箱中。使用前将2溶液各20毫升混合， 用烝馏水稀释至100毫升。5）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。6）氮的标准溶液：精确称取0.4717克硫酸铵溶于水并稀释至1000mL,得到 1mL含有0.1mg氮的标准液。（三）测定步骤（1）标准曲线绘制吸取配置好的氮溶液10mL,定容至100mL,即稀释了 10倍，吸取1, 3,5, 7, 9, 11, 13mL移至50mL容量瓶，加水至20mL,再加入4mL苯酚钠，仔 细混合，加入3mL次氯酸钠，充分摇荡，放置20分钟用水稀释至刻度。将着色 液在紫外分光光度计上于578nm处进行比色测定，以

3、标准溶液浓度为横坐标， 以光密度值为纵坐标绘制曲线图。（2） 土壤中脲酶活性的测定称取10 g 土壤置于100mL容量瓶中。用2mL甲苯处理15分钟。往瓶中 加入10mL 10%尿素溶液和20mL柠檬酸缓冲液（pH6.7）。仔细混合后，将瓶放 在37C。恒温箱中，放置3 h。与此同时，进行以水代替基质，及无土壤的基质对 照测定。培养结束后，用热至38C的水稀释至刻度。摇匀，将悬液过滤。吸取1mL 滤液于50mL容量瓶中，用蒸馏水加至10mL。然后按标准曲线绘制的操作加入 苯酚钠等试剂，显色，比色，最后根据标准曲线求出氨态氮含量。以每克土壤在37C下24h内酶解尿素释放的NH3-N的毫克数来表示

4、脲酶活 性。土壤蛋白酶活性测定方法：铜盐比色法（一）方法原理本法基于以精胶为基质，酶解后所释放的氨基酸使其与铜盐反应形成蓝色复 合物。用比色测定颜色深度，计算出氨基酸含量，来度量酶的活性。（二）试剂1）1%精胶2）甲苯3）铜-磷酸盐溶液： 27.3g CuCl H O 溶于 1 L 水；64.5g Na HPO 12H O22242溶于500mL水，加入7.2g NaOH,稀释至1L :57.21g Na B O溶于1.5L水，2 47加入100毫升0.1 mol/L HCL稀释至2L,使用按照1：2：2的体积分数前将上述 、混合。4）甘氨酸标准溶液的配制：取 267.9mg 甘氨酸溶于蒸馏水

5、,稀释至 1 L （1mL 含 50pg NH3-N）。（三）操作步骤（1）标准曲线绘制取0、5、10、15、20 mL甘氨酸标准溶液，用蒸馏水加至20 mL，然后加 入20 mL新配制的铜-磷酸盐溶液。显色后，用分光光度计在650nm处测定， 绘制标准曲线。（2）土壤蛋白酶活性测定称取5g 土壤置于100mL三角瓶中，加入甲苯2mL，放置15 min，加入 20mL 1%精胶溶液，于37C恒温培养24h，于此同时，以水代替基质作为对照。培养结束后，将悬液过滤，取10mL滤液，加水10mL，铜-磷酸盐溶液20mLo 显色后，用分光光度计在650nm处测定，根据标准曲线求出NN含量。以每克土壤在

6、37C下24h内酶解蛋白质释放的NH3-N的质量（pg）表示蛋 白酶活性。土壤磷酸酶测定方法：磷酸苯二钠法（一）方法原理 本法基于以磷酸苯二钠为基质，酶解释放出的酚，使其与氯代二溴对苯醌亚 胺试剂反应生色。用比色法测定出游离的酚量，用以表示磷酸酶活性。（二）试剂配制1）0.5磷酸苯二钠（用缓冲液配制）；2）pH5醋酸盐缓冲液、pH7柠檬酸盐缓冲液、pH9.4硼酸盐缓冲液；3）氯代二溴对苯醌亚胺试剂：取 0.125g 2,6-二溴苯醌氯酰亚胺，用 10mL 96乙醇溶解，贮于棕色瓶中，存放在冰箱里。保存的黄色溶液未变褐色之前均 可使用；4）酚的标准溶液：酚原液取1g重蒸酚溶于蒸馏水中，稀释至1L

7、,贮于棕色瓶中； 酚工作液取 10mL酚原液稀释至1L （每毫升含0.01毫克酚）；5）甲苯；6）0.3硫酸铝溶液。（三）操作步骤1）标准曲线绘制取 1、3、5、7、9、11 和 13mL 酚工作液，置于 50mL 容量瓶中，每瓶加 入5mL缓冲液和4滴氯代二溴对苯醌亚胺试剂，显色后稀释至刻度，即得0.0002、 0.0006、0.0010、0.0014、0.0018、0.0022 和 0.0026mgg-1 浓度的酚标准溶液梯 度。30min后比色测定。绘制标准曲线。（2）土壤磷酸酶的测定称取5g风干土置于200mL三角瓶中，加2.5mL甲苯，轻摇15min后，加 入 20mL 0.5磷酸苯

8、二钠（酸性磷酸酶用醋酸盐缓冲液；中性磷酸酶用柠檬酸 盐缓冲液；碱性磷酸酶用硼酸盐缓冲液），仔细摇匀后放入恒温箱，在37C下培 养24h。后于培养液中加100mL 0.3%硫酸铝溶液并过滤。吸取 3mL 滤液于 50mL 容量瓶中，然后按绘制标准曲线所述方法显色。用 硼酸缓冲液时，呈现蓝色，在风光光度计上于660nm处比色。磷酸酶活性，以37C下24h后1g 土壤中释放处的酚的毫克数表示。土壤蔗糖酶测定方法：3,5- 二硝基水杨酸比色法（一）方法原理蔗糖酶酶解所生成的还原糖与 3,5- 二硝基水杨酸反应而生成橙色的 3-氨 基-5-硝基水杨酸。颜色深度与还原糖量相关，因而可用测定还原糖量来表示蔗

9、 糖酶的活性。（二）试剂1）酶促反应试剂：基质5%蔗糖（用pH5.5磷酸缓冲液配制）；甲苯2）葡萄糖标准液（1mg/mL）预先将分析纯葡萄糖置80C烘箱内约12小时。准确称取500mg葡萄糖于 烧杯中，用蒸馏水溶解后，移至500mL容量瓶中，定容，摇匀（冰箱中4C保 存期约一星期）。若该溶液发生混浊和出现絮状物现象，则应弃之，重新配制。3）3,5-二硝基水杨酸试剂（DNS试剂）将5.0g 3,5-二硝基水杨酸溶于200mL 2N NaOH溶液中（不适宜用高温促溶）， 接着加入500mL含130g酒石酸钾钠的溶液，混匀。再加入5g结晶酚和5g亚 硫酸钠，搅拌溶解后，定容至1000mL。暗处保存备

10、用。（三）测定步骤（1）标准曲线绘制分别吸1 mg/mL的标准葡糖糖溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL于试管中， 再补加蒸馏水至1mL，加DNS试剂3mL混匀，于沸水浴中准确反应5min （从试 管放入重新沸腾时算起），取出立即泠水浴中冷却至室温，以空白管调零在波长 540nm处比色，以OD值为纵坐标，以葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线。（2）土壤蔗糖酶测定称取5 g 土壤，置于100mL三角瓶中，加10 mL水、1mL甲苯。摇匀土壤均匀分散后，放置15分钟，加入15mL5%蔗糖-磷酸缓冲液。摇匀、塞紧，放于37C。恒温箱中，培养24h。按此操作，用不加土壤的基质和150C。干热

11、灭菌1h 的土壤进行对照试验。培养结束后，用滤纸过滤，取 1mL 滤液，按绘制标准曲 线方法，测定并由标准曲线其中还原糖含量。土壤蔗糖酶活性，以1g 土壤在37C。时，24h释放出的葡萄糖毫克数来表示。过氧化氢酶测定（容量法）试剂配制0.3%过氧化氢溶液：按1:100将30%H2O2用水稀释3N 硫酸0.1N高锰酸钾（1/5KMnO4）溶液：称取化学纯高锰酸钾3.161g，溶于1升无CO2 蒸馏水中，贮于综色瓶中，备用。操作步骤取2g风干土，置于100mL三角瓶中，并注入40mL蒸馏水和5mL 0.3%H2O2溶液。（2）同时设置对照，即三角瓶中注入40mL蒸馏水和5mL 0.3%过氧化氢溶液

12、，而不加土样。 将三角瓶放在振荡机上振荡20min后，加入5mL3N硫酸，以稳定未分解的过氧化氢。再将瓶中悬液用慢速滤纸过滤。吸取25mL滤液，用0.1 N高锰酸钾滴定至淡粉红色终点。结果计算用于滴定土壤滤液所消耗的高锰酸钾量（毫升数）为B，用于滴定25mL原始的过氧化 氢混合液所消耗的高锰酸钾量（毫升数）为A。（A-B） xT即为过氧化氢酶活性。以20min后1g 土壤的0.1N高锰酸钾的毫升数表示。 式中T为高锰酸钾滴定度的校正值。(就是最后换算成每克，所以还要测土壤含水量)高锰酸钾溶液标定称取0.2g (准至O.OOOIg)于105110C。烘至恒重的基准草酸钠。溶于100mL (8+9

13、2)硫 酸溶液中，用配制好的高锰酸钾溶液c (KMnO4) =0.1mol/l滴定，近终点时加热至65C, 继续滴定至溶液呈粉红色保持30s,同时作空白试验。高锰酸钾溶液标准浓度按下式计算 c(1/5KMnO4)=m/(V1-V2)*0.06700式中 c (1/5KMnO4)二一高锰酸钾标准液之物质的量浓度，mol/L ；m草酸钠之质量，g ；V高锰酸钾溶液之用量，mL；V2空白试验用高锰酸钾溶液之用量，mL；0.06700与1.00mL高锰酸钾溶液c (1/5KMnO4) =1.000mol/1相当的以克表示的草 酸钠的质量。脱氢酶测定(比色法)取20g 土壤于50ml三角瓶中，加0.2g

14、碳酸钙。混匀后加2mil%三苯基四唑 氯化物，再加水至最大持水量的90%，在恒温恒湿培养箱中(30C，相对湿度 70%)培养24h。培养结束后，加25ml甲醇，振荡5min,过滤。再用甲醇多次 洗涤漏斗上的土壤，直至获得无色滤液。合并滤液和洗液并定容50ml或100ml, 在分光光度计上于 460nm 处比色。标准曲线的绘制吸取10ml分别含20300微克的三苯基四唑氯化物溶液, 加 10mgNaHSO3 还原,显色后在分光光度计上于 460nm 处比色测定并绘制标 准曲线。酶活性表示及计算：以20g 土壤中氢离子的微升数表示。X=av*150.35式中：a1ml滤液中甲醇的毫克数(查标准曲线)V滤液体积（ml） 150.35将甲醇量换算成氢的体积（微升）的系数多酚氧化酶活性的测定邻苯三酚比色法（1）标准曲线的绘制取重铬酸钾标准溶液，用 0.5mol/LHCl 稀释成各种不同浓度。定容后，在分 光光度计上于 430nm 处比色测定。以光密度值为纵坐标，以浓度为横坐标绘制 标准曲线。（2）操作步骤称取 1g 风干土壤样品（过 0.25mm 筛），置于 50mL 三角瓶中，然后注入 10mL1%邻苯三酚溶液，将瓶内含物摇荡后放在30C恒温箱培养2h。取出后加 4mLPH4.5柠檬酸一磷酸缓冲液，再加35mL乙醚用力摇荡数