大豆品种抗炭疽病性鉴定技术规程-标准文本

1、Q/LB.XXXXX-XXXX目次 TOC o 1-1 h t 标准文件_一级条标题,2,标准文件_附录一级条标题,2, HYPERLINK l _Toc103017343 前言 PAGEREF _Toc103017343 h II HYPERLINK l _Toc103017344 1 范围 PAGEREF _Toc103017344 h 1 HYPERLINK l _Toc103017345 2 规范性引用文件 PAGEREF _Toc103017345 h 1 HYPERLINK l _Toc103017346 3 术语和定义 PAGEREF _Toc103017346 h 1 HYPE

2、RLINK l _Toc103017347 3.1 大豆炭疽病 soybean anthracnose PAGEREF _Toc103017347 h 1 HYPERLINK l _Toc103017348 3.2 病情指数 disease index PAGEREF _Toc103017348 h 1 HYPERLINK l _Toc103017349 4 鉴定试验条件 PAGEREF _Toc103017349 h 1 HYPERLINK l _Toc103017350 4.1 接种体制备所需仪器设备及工具 PAGEREF _Toc103017350 h 1 HYPERLINK l _To

3、c103017351 4.2 鉴定圃 PAGEREF _Toc103017351 h 1 HYPERLINK l _Toc103017352 5 接种体制备 PAGEREF _Toc103017352 h 2 HYPERLINK l _Toc103017353 5.1 病原菌选择与培养 PAGEREF _Toc103017353 h 2 HYPERLINK l _Toc103017354 5.2 接种体制备 PAGEREF _Toc103017354 h 2 HYPERLINK l _Toc103017355 6 鉴定程序 PAGEREF _Toc103017355 h 2 HYPERLINK

4、 l _Toc103017356 6.1 供试品种种植 PAGEREF _Toc103017356 h 2 HYPERLINK l _Toc103017357 6.2 接种方法 PAGEREF _Toc103017357 h 2 HYPERLINK l _Toc103017358 6.3 鉴定圃田间管理 PAGEREF _Toc103017358 h 3 HYPERLINK l _Toc103017359 6.4 病情调查记载 PAGEREF _Toc103017359 h 3 HYPERLINK l _Toc103017360 6.5 结果计算 PAGEREF _Toc103017360 h

5、 3 HYPERLINK l _Toc103017361 6.6 抗性评价标准 PAGEREF _Toc103017361 h 3 HYPERLINK l _Toc103017362 附录A（规范性） 马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）制备 PAGEREF _Toc103017362 h 5 HYPERLINK l _Toc103017363 附录B（资料性） 大豆炭疽病基本信息 PAGEREF _Toc103017363 h 6 HYPERLINK l _Toc103017364 附录C（规范性） 大豆品种抗炭疽病性鉴定病情调查记载表 PAGEREF _Toc103017364 h 7 HYP

6、ERLINK l _Toc103017365 附录D（规范性） 大豆品种抗炭疽病性鉴定结果报告表 PAGEREF _Toc103017365 h 8前言本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由四川省农业农村厅提出并归口。本文件起草单位：四川省农业科学院经济作物育种栽培研究所、四川省农业农村厅植物保护站。本文件主要起草人：何炼、曾华兰、叶鹏盛、尹勇、刘勇、蒋秋平、张梅、华丽霞、孙小芳、韦树谷、代顺冬、赖佳、黄玲、盛玉珍、张骞方。大豆品种抗炭疽病性鉴定技术规程范围本文件规定了大豆炭疽病接种体制备、接种方法及抗性评价标准。本文件适用于

7、大豆品种炭疽病抗性评价。规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 5084 农田灌溉水质标准GB/T 8321.3 农药合理使用准则（三）GB/T 8321.4 农药合理使用准则（四）GB/T 8321.6 农药合理使用准则（六）NY/T 1276 农药安全使用规范 总则术语和定义下列术语和定义适用于本文件。大豆炭疽病 soybean anthracnose大豆炭疽病是由炭疽菌引起的病害，主要发生在大豆结荚以后，尤其是鼓粒期的大豆。发

8、病初期，病斑呈水渍状细小斑点，在高温高湿环境下，迅速扩大为黄褐色或红锈色不规则形病斑，严重影响豆荚的商品性。发病重时，鼓粒初期的豆荚即迅速枯死。病情指数 disease index衡量发病率与严重度的综合指标。用各病级数值与对应病级的病荚数乘积的总和与全部调查豆荚的理论最高总病级数总和的比较相对数表示，记作DI。供试品种的病情指数均值为各重复病情指数的平均数，记作ADI。鉴定试验条件接种体制备所需仪器设备及工具光学显微镜、高压灭菌锅、超净工作台、恒温培养箱、冰箱、移液器、血球计数板、培养皿、量筒、挑针、涂布棒、酒精灯、镊子、广口瓶、纱布等。鉴定圃立地条件鉴定圃应地势平整、形状规正、肥力均匀、排

9、灌方便、不受荫蔽，并具备人工保湿条件。面积根据供试品种数量确定鉴定圃面积。每个供试品种不少于5m2。接种体制备病原菌选择与培养病原菌选择采集四川省生产上大豆炭疽病的典型病样，在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）平板上分离纯化后作为鉴定用病原菌。马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）见附录A。病原菌培养将保存的病原菌转接到PDA平板上，置于2528下恒温培养6d，在超净工作台上用涂布棒将菌丝涂断以促进产孢，用封口膜封口，置于26下恒温培养3d。接种体制备在培养好的大豆炭疽菌平板中加入适量0.05%吐温-80溶液，用涂布棒刮下大豆炭疽病菌分生孢子，菌悬液经四层脱脂纱布滤除菌丝，收集滤液，用血球计数板检测滤液中孢

10、子浓度，添加适量0.05%吐温-80溶液，配制成1106个mL-1的孢子悬浮液，按20g/L添加酵母粉并充分搅拌使其溶解，作为抗性鉴定接种体。接种体应即配即用。鉴定程序供试品种种植根据供试品种生育期调整播期，使各品种同一时期进入始荚期。根据供试品种株型，按照行距6080cm、穴距3035cm播种，每穴播种34粒、定苗2株，每品种每重复至少保苗20株。各品种随机排列，重复3次。设置感病品种台湾75为感病对照。接种方法接种时间大豆始荚期进行第一次接种，7d后进行第二次接种。接种部位大豆荚。接种量及接种方法每次按每株20mL接种体对豆荚表面均匀喷雾进行接种，接种后保湿48h。鉴定圃田间管理肥水管理按

11、常规施肥水平施用化肥和腐熟有机肥。如遇干旱，应及时灌溉。灌溉水应符合GB 5084的规定。病虫草害管理及时中耕、除草、防治虫害，供试品种全生育期不使用杀菌剂和除草剂。使用农药防治虫害时，应符合GB/T 8321.3、GB/T 8321.4、GB/T 8321.6和NY/T 1276的规定。病情调查记载第二次接种后，逐日监测感病对照发病情况，当感病对照的病情指数达到50时，每小区摘取不少于10株的全部结实豆荚，豆荚总数不少于300个，逐荚调查发病情况。病情分级标准见表1，病情调查记载表见附录C。大豆炭疽病病情分级标准病情级别症状0豆荚无病斑1病斑面积占整个豆荚面积的5%以下3病斑面积占整个豆荚面

12、积的6%10%5病斑面积占整个豆荚面积的11%25%7病斑面积占整个豆荚面积的26%50%9病斑面积占整个豆荚面积的50%以上结果计算病情指数病情指数按公式（1）计算。DI=(dc式中：DI病情指数dc病情级别数值nc各病级豆荚数nt调查总豆荚数抗性评价标准根据供试品种的病情指数均值评价各品种的抗性级别，抗性级别划分标准见表2，大豆品种抗炭疽病性鉴定结果报告表见附录D。大豆品种炭疽病抗性级别划分标准病情指数均值（ADI）抗性类型ADI5.00高抗（HR）5.00ADI10.00抗病（R）10.00ADI20.00中抗（MR）20.00ADI40.00中感（MS）40.00ADI60.00感病（

13、S）ADI60.00高感（HS）（规范性）马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）制备将200g去皮马铃薯切成小块，加水1L煮沸并维持20min,用四层纱布过滤，滤液中趁热加入20g葡萄糖、20g琼脂，玻棒搅拌并加水定容至1L，121下蒸汽灭菌30min。冷却至60左右，每100mL培养基加入100g/mL的硫酸链霉素100L，混匀后倒平板。（资料性）大豆炭疽病基本信息大豆炭疽病是由炭疽菌引起的病害，主要发生在大豆结荚以后，尤其是鼓粒期的大豆。发病初期，病斑呈水渍状细小斑点，在高温高湿环境下，迅速扩大为黄褐色或红锈色不规则形病斑，严重影响豆荚的商品性。发病重时，鼓粒初期的豆荚即迅速枯死。品种抗性、病原

14、物致病力、温湿度和降雨均能影响大豆炭疽病的发生流行。2530有利于病原菌菌丝生长和产孢。风雨有利于分生孢子的传播蔓延，同时，雨滴也有利于分生孢子的萌发和附着胞的形成。夏秋季节大豆鼓粒期如遇阴雨连绵或晴雨相间天气，种植感病品种的田块易出现大豆炭疽病的爆发流行，严重时豆荚染病率超过50%。（规范性）大豆品种抗炭疽病性鉴定病情调查记载表大豆品种抗炭疽病性鉴定病情调查记载表编号品种名称重复各病级荚数（个）病情指数0级1级3级5级7级9级123调查人：记载人：调查时间：（规范性）大豆品种抗炭疽病性鉴定结果报告表大豆品种抗炭疽病性鉴定结果报告表编号品种名称病情指数均值抗性类型123感病对照大豆品种抗炭疽病

15、性鉴定技术规程编制说明一、工作简况1.任务来源根据四川省市场监督管理局关于下达2020年度地方标准制修订项目立项计划（第四批）的通知（川市监函2020560号），由四川省农业科学院经济作物育种栽培研究所与四川省农业农村厅植保站共同负责立项计划汇总表中第36项大豆品种抗炭疽病性鉴定技术规程的起草。本项目起草人： 何炼、曾华兰、叶鹏盛、尹勇、刘勇、蒋秋平、张梅、华丽霞、孙小芳、韦树谷、代顺冬、赖佳、黄玲、盛玉珍、张骞方，联系电话大豆是四川的主要作物，由平头炭疽菌引起的大豆豆荚炭疽病是造成大豆减产、品质下降的主要病害，选育推广抗病品种是防治该病最经济有效的方法。而品种的抗病

16、性评价，是筛选抗源和对育成品种的抗病性进行把关的不可缺少的手段。尽管国内已有一些科研单位开展了大豆抗炭疽病性鉴定方面的研究，但尚无相应的国家标准，且各单位采用的抗性鉴定方法也不相同。不同地区的大豆品种抗性存在显著差异，且由于菌株、气候等因素的差异，同一品种在不同地区的抗性表现也有所不同。因此，有必要制定大豆品种抗炭疽病性鉴定技术规程，规范我省大豆品种抗炭疽病性鉴定工作，推动我省大豆抗病品种选育和大豆生产发展。2.编制单位四川省农业科学院经济作物育种栽培研究所、四川省农业农村厅植保站。3.主要工作过程3.1调查研究从2015年起，团队在金堂、仁寿、西充、自贡等大豆主产区对大豆炭疽病发生情况开展调

17、查，研究了病害发生流行规律；并采集病样进行了病原菌分离纯化鉴定、培养扩繁、接种鉴定、评价大豆品种抗性等研究。经过反复试验，研究明确了菌种制备、接种方法、接菌量、鉴定条件、调查分级方法和抗性等级划分标准等，形成了一套大豆品种抗炭疽病性鉴定技术。3.2标准起草自2020年接受四川省市场监督管理局下达的“大豆品种抗炭疽病性鉴定技术规程”制定任务后，标准编制组通过网络、文献检索等手段广泛收集信息、资料，开展调查研究，结合大豆品种抗炭疽病性鉴定技术的研究成果和生产实践，经过多次内部讨论后，初步明确了标准制订的框架，并按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定编

18、写了本地方标准的工作组讨论稿。二、标准编制原则和确定标准主要技术内容的论据1.主要参考资料GB 5084 农田灌溉水质标准GB/T 8321 农药合理使用准则NY/T 1276 农药安全使用规范 总则2.标准的主要内容2.1范围本标准规定了大豆炭疽病接种体制备、接种方法及抗性评价标准。本标准适用于大豆品种抗炭疽病性评价。2.2规范性引用文件本规范所引用的国家、行业有关规范、规程均为现行且有效的，条文中给出编号，以便于使用时查找。2.3术语和定义该部分的术语和定义，“3.1 大豆炭疽病”主要参考孙志峰等1研究，并根据本团队的调查研究结果进行定义，“3.2 病情指数”主要参考2016年1月科学出版

19、社出版的植物病理学中关于病情指数的定义，即病情指数用各病级数值与对应病级的病荚数乘积的总和与全部调查豆荚的理论最高总病级数总和的比较相对数表示。2.4鉴定试验条件2.4.1接种体制备所需仪器设备及工具依据病原真菌分离培养检测需求和标准编制组工作实践，明确了接种体制备所需仪器设备及工具为光学显微镜、高压灭菌锅、超净工作台、恒温培养箱、冰箱、移液器、血球计数板、培养皿、量筒、挑针、涂布棒、酒精灯、镊子、广口瓶、纱布等。2.4.2鉴定圃根据农作物田间试验设计基本原则和病害发生流行规律，规定了鉴定圃的立地条件和面积。2.5接种体制备2.5.1病原菌选择与培养根据标准编制组研究成果，结合病原真菌生物学特

20、性和四川大豆产区生产实际，确定了病原菌选择和病原菌培养方法，并在附录中给出了PDA培养基制备方法。2.5.2 接种体制备根据标准编制组研究成果，结合四川大豆炭疽病病害发生流行规律及病原菌生物学特性，确定了接种体制备方法。2.6鉴定程序2.6.1供试品种种植根据标准编制工作组试验研究及承担四川省和重庆市区试大豆抗病性鉴定工作实践，确定了供试品种种植的行距、穴距、每穴播种量和感病对照品种。2.6.2接种方法根据大豆炭疽病病害发生流行规律和标准编制工作组对大豆品种抗炭疽病性鉴定方法研究的结果，确定了接种时间、接种部位、接种量及接种方法。2.6.3鉴定圃田间管理根据GB 5084、GB/T 8321和

21、NY/T 1276的规定，结合标准编制组研究结果，对肥水管理和病虫草害管理做了规定。2.6.4病情调查记载根据标准编制组研究结果，对病情调查记载方法做了规定，并在附录中给出了大豆品种抗炭疽病性鉴定病情调查记载表。2.6.5结果计算根据病情指数的定义，结合标准编制组研究结果，规定了病情指数的计算方法和大豆品种抗炭疽病性评价标准，并在附录中给出了大豆品种抗炭疽病性鉴定结果报告表。三、主要试验分析报告、技术经济论证和预期经济效果1.试验分析报告1.1接种体制备方法的确立本研究团队采集了四川大豆主产区的大豆炭疽病典型病样，经分离纯化鉴定及回接致病力检测后作为抗性鉴定用病原菌。分生孢子是大豆炭疽菌无性繁

22、殖的基本单位，与使用菌丝段液接种相比，使用分生孢子悬浮液进行喷雾接种具有不易堵塞喷头、易于计量的优点。因此，获得足够多的分生孢子是开展大豆品种抗炭疽病性鉴定的基础。孙志峰等1研究认为，大豆炭疽菌菌株XST01在PDA培养基上25培养7d，可产生1.0108cfu/皿以上孢子量。赵胜等2用分离自中国农业科学院油料作物研究所阳逻实验基地大豆病荚的平头炭疽菌开展研究，结果表明，在9g/L蔗糖浓度的燕麦培养基上，7d即可产生2.0109cfu/皿以上孢子量。本研究团队采用分离自四川大豆主产区大豆炭疽病典型病样的炭疽菌菌株SCCT01、SCCT02进行相关研究表明，两个菌株在PDA和燕麦培养基上26培养

23、6d，均只能产生1.0105cfu/皿的孢子，培养至10d，孢子量仅能达到1.0106cfu/皿，无法满足品种抗病性鉴定试验需求。郭春秋3、黄军凯4等研究表明，一部分真菌通过预培养、扫刷营养体造成菌丝受伤，能够控制营养生长，促进产孢。据此，本研究团队将炭疽菌菌株SCCT01、SCCT02接种到PDA上，26预培养6d，用涂布棒将菌丝涂断后，26培养3d，加入适量0.05%吐温-80溶液洗下分生孢子，用血球计数板检测孢子含量，结果表明，孢子量可达1.0108cfu/皿以上，能够更好地满足品种抗病性鉴定试验需求。接种孢子悬浮液后，创造有利于孢子萌发的环境条件，是开展品种抗病性鉴定的关键。孙志峰等1

24、研究表明，大豆炭疽菌分生孢子对相对湿度和营养的要求较高，在RH为97%以上时才能萌发，但在无菌水中不能萌发，在2%葡萄糖溶液中6h萌发率为60.5%62.9%，在2%酵母粉溶液中6h萌发率为100%。因此，本团队在制备接种体时，在孢子悬浮液中添加了2%酵母粉，用以促进孢子萌发。1.2鉴定程序的确立1.2.1供试品种种植密度和感病对照品种的确立确立种植密度：团队在开展大豆炭疽病抗性鉴定方法研究的过程中发现，如果按照生产上习惯的4050cm行距进行播种，行距过窄不利于接种和调查操作。因此，将行距设置为6080cm。确立感病对照品种：我国对于严重影响豆荚商品性和经济价值的炭疽病的重视，始于本世纪初鲜

25、食大豆品种台湾75“锈斑病”的爆发。陈吴健5等报道，2004年，杭州市萧山区种植台湾75的一般田块病株率约为50%，病荚率约为30%，重病田块病株率90%以上，病荚率50%以上。本团队采用1106个mL-1的孢子悬浮液接种台湾75、交大133、辽鲜3号、春丰早等品种开展感病对照品种筛选，并参照DB35/T 1574-2016病情分级标准6（表1）调查大豆炭疽病发生情况，计算病情指数，参考DB35/T 1574-2016品种抗性评价标准（表2）评价品种抗性型，结果见表3。试验结果表明，台湾75表现为感病，且年度间发病较稳定。因此，将台湾75设置为感病对照品种。表1 大豆炭疽病病情分级标准病情级别

26、症状0豆荚无病斑1病斑面积占整个豆荚面积的5%以下3病斑面积占整个豆荚面积的6%10%5病斑面积占整个豆荚面积的11%25%7病斑面积占整个豆荚面积的26%50%9病斑面积占整个豆荚面积的50%以上表2 大豆品种抗炭疽病评价标准病情指数（DI）抗性评价DI=0高抗（HR）0DI10.00抗病（R）10.00DI20.00中抗（MR）20.00DI40.00中感（MS）40.00DI60.00感病（S）DI60.00高感（HS）表3 大豆抗炭疽病性鉴定感病对照品种筛选结果年度品种名称病荚率/%病情指数抗性型2019年台湾75100.0052.99感交大13374.6729.93中感辽鲜3号79.

27、3327.48中感春丰早95.4335.99中感2020年台湾7596.0054.27感交大13371.3331.48中感辽鲜3号81.1129.90中感春丰早86.8936.12中感1.2.2接种方法确立接种部位：根据大豆炭疽病病害发生流行特点，确定了接种部位为大豆荚。确立接种浓度、接种时间和接种量：在接种预试中，本团队发现，采用背负式电动喷雾器进行喷雾接种时，如果参照DB35/T 1574-2016中的规定，每株植株喷10mL孢子悬浮液，难于均匀覆盖全部豆荚，采用手持式电动喷壶进行喷雾接种虽然能够完全覆盖全部豆荚，但接种所需花费的时间过多，接种效率过低。将接种量提高到每株20mL孢子悬浮液

28、后，采用背负式电动喷雾器进行喷雾接种，既能保证接种体均匀覆盖全部豆荚，又能提高接种效率。参照DB35/T 1574-2016中的接种方法，分别采用1104个mL-1、1105个mL-1、1106个mL-1的孢子悬浮液对台湾75、交大133、春丰早等品种进行接种，比较大豆始荚期接种一次，7d后进行第二次接种的方法与大豆始荚期接种一次的方法对参试品种炭疽病发病的影响，结果见表4。试验结果表明，采用1106个mL-1的孢子悬浮液于大豆始荚期接种一次，7d后进行第二次接种的方法，有利于参试品种的充分发病。表4 不同接种浓度、接种次数、对大豆品种炭疽病发病的影响接种浓度接种次数品种名称病荚率/%病情指数抗性型1104个mL-1接种1次台湾7583.3325.06中感交大13354.228.05抗春丰早64.899.98抗接种2次台湾7596.6739.68中感交大13369.3316.89中抗春丰早59.3316.77中抗1105个mL-1接种1次台湾7582.4429.21中感交大13356.0013.83中抗春丰早61.1113.16中抗接种2次台湾7595.7845.56感交大13376.4420.20中感春丰早84.6720.86中感1106个mL-1接种1次台湾7584.4430.77中感交大13354.8915.0