荧光辐射机理

1、1光致电子转移(PET)递给荧光基团的键合基团(RecePtor)，负责光吸收并产生荧光发 射信号的荧光基团(Fluorophorc)其荧光发射强度反映键合基团的结 合状态，以及连接键合集团和荧光基团的连接基团(Spacer)o键合基 团和荧光基团通常为电子给体或者电子受体。光致电子转移是指电子给体或电子受体受光激发后，激发态的电 子给体与电子受体之间发生电子转移从而导致荧光的淬灭过程。例 如，当荧光分子传感器的键合基团是电子给体，荧光基团是电子受体 时，具体PET作过程如下:在光激发下，具有电子给予能力的键合基 团能够将其处于最高能级的电子转入激发态下荧光基团空出的电子 轨道，使被光激发的电

2、子无法直接跃迁巨到原基态轨道发射荧光， 从而导致荧光的淬灭；当键合基团与底物结合后，降低了键合基团的 给电子能力，抑制了 PET过程，荧光基团中被光激发的电子可以直 接跃迁回到原基态轨道，从而增强了的荧光基团的荧光发射。因此在 未结合底物前，传感器分子表现为荧光淬灭，一旦键合基团与底物相 结合，荧光基团就会发射荧光(见图)由于与客底物结合前后的荧光强度差别很大，呈现明显的“关”、“开” 状态，因此这类荧光化学传感器又被称为荧光分子开关。PET荧光分 子传感器的作用机制可由前线轨道理论“来进一步说明(见图1.5)。ICT荧光化学传感器由推电子基团、吸电子基团通过p电子体系连接 而成，在基态时表现

3、为极化结构，一端为缺电子部分，另一端为富电子部分;而在光激发下，偶极矩增大，强化了这种极化特征，容易发生ICT过程（如图）。A +cKLlmrt dondilmgpsiilp-systemckilruni wuhUra 讪 H穿U 4-1kvG -donuliing pjirtp-sternkclrom wiiihdrf ing;一* 图】尚分r内电荷转移的产生原理thiojesccnccICT荧光化学传感器的工作原理有两种（见图l.7a）:当底物是缺电子基 团（阳离子）时，一种是底物与吸电子基团结合，将增大分子内电荷转 移程度，导致荧光光谱红移;一种是底物与推电子基团结合，则使原 来向共扼体

4、系转移的孤对电子用于与阳离子形成配位键，导致ICT 推一拉电子的特征下降，导致荧光光谱蓝移。当底物是富电子基团（阴 离子）时，情况相反。一般情况下，ICT荧光化学传感器对荧光强度 的影响不如PET荧光化学传感器显著。典型例子是同时含有吸电子取代基、推电子取代基的电子体系，如氨基邻苯二甲酞亚胺、二苯基 烯、氟代香豆素等。ICT荧光化学传感器的缺点是对外部环境的变化 十分敏感，有较强的溶剂化效应。(b) reaction coordinaie(a) reaction coordinate(b) reaction coordinaie(a) reaction coordinate图1.7以分子内共辄

5、的电荷转秒化合物为槌飓器的筮花部件时，其工作花况的势能图说明I在ICT中，有一种情况被称为扭曲的分子内电荷转移(TICT twisted Intramolecular charge transfer)。在具有推一拉电子共扼体系的荧光分 子中，如果推电子基(如二甲氨基)通过可旋转的单键与荧光团相连 接，当荧光团被光子激发时，由于强烈的分子内光致电荷转移，导致 原来与芳环共平面的电子给体绕单键旋转，而与芳环平面处于正交状 态，原来的共辘系统被破坏，部分电荷转移变为完全的电子转移，形 成TICT激发态(见图)。当形成TICT激发态时，原有的ICT荧光则 被淬灭。TICT态常常不发射荧光或者发射弱的长

6、波荧光，少数情况 下会出现ICT与TICT双重荧光现象。3荧光共振能量转移(FRET)FRET荧光传感器分子的组成与其他类型传感器有所不同，除了含有键合基团(Receptor)彩!连接基团(Spacer),还含有两个负责光吸收井产 生荧光发射信号荧光基团(FluoroPhore),而这两个荧光基团一个是能 量给体(Energy donor， D)，另一个是能量受体(Energy acceptor， A)。 荧光共振能量转移是指在一定波长的光激发下，荧光基团中的能量给 体(D)产生荧光发射，并通过偶极一偶极之间的相互作用把能量无辐 射地转移给其附近的处于基态的能量受体(人)荧光基团的过程。FRE

7、T 过程的发生与很多因素如光谱重叠的程度、跃迁偶极的相对方向，给 体)和受体0)之间的距离等有关。首先，能量给体)的发射光谱 与能量受体(A)的吸收光谱有明显的重叠，能量受体必须能够在能量 给体的发射波长处吸收能量，但能量受体可以是荧光发射基团，也可 以是荧光淬灭基团。对于前一种情形，激发能量给体时，可以观察到 能量受体的荧光发射;而后一种情形，只能观察到能量给体的荧光变 化。其次，能量给休与能量受休相隔的距离必须远大于它们之间的碰 撞直径(有时甚至相距远达70-100A)时，才可能发生能量给体与能量 受体的非辐射能量转移，又称为长距离能量转移。另外，能量给休(。) 与能量受体(A)还必须以适

8、当的方式排列。利用FRET效率对距离的 强的依赖性，FRET广泛应用于蛋白质和核酸的结构及动力学研究、 分子结合的测定等领域。例如，当荧光分子传感器的两个荧光基团都是荧光发射基团时，具体 FRET工作过程如下(见图1.8):在光激发下，荧光基团中的能量给休(D) 产生荧光发射;传感器分子通过键合基团键合底物来调节能量给体(D) 和能量受体(A)之间的距离以及排列方向。如果底物的加入使这些因素均在适当范围，能量给体)可将能量通过非辐射转移给能量受体 (A),表现为能量受体(A)的荧光发射;如果底物的加入使这些因素与 FRET因素不能匹配，则会抑制FRET过程，则表现为能量给体(。) 的荧光发射(

9、图)。4 激基缔/ 复合物(exeimer/exciplex)基于激基缔/复合物(excimer/exciplex)的荧光化学传感器分子的 特点是在一个分子中含有两个荧光基团，如多环芳烃蔡、蒽和花等， 并且两个基团处于分子的合适位置。当两个荧光基团相同时，其中一 个荧光基团(单体)被激发后，会和另一个处于基态的荧光基团形成分 子内激基缔合物(excimer)。激基缔合物的荧光发射光谱取代了单体的 发射峰，呈现出一个新的强而宽的、长波长的、无精细结构的荧光发 射峰。当两个荧光基团不同时，则称之为激基复合物(exciplex)。激基 缔/复合物形成与否的关键是两个荧光基团之间的距离，只有激发态分子

10、与基态分子之间的距离约为3.5A时，才能形成激基缔/复合物。基于激基缔/复合物(excimer/exciplex)的荧光化学传感器就是利 用受体结合底物后导致激基缔/复合物构型的形成或破坏，使激基缔/ 复合物的荧光增强或消失，通过单体、激基缔/复合物的荧光光谱变 化表达底物识别的信息。因此，构型的变化是此类信息产生的原因， 图给出了加入底物后可以形成激基缔合物的荧光化学传感器的工作 原理。蔡、花、蒽等荧光团由于具有较长的激发单线态寿命，容易形 成激基缔/复合物，常常被用于此类荧光化学传感器中。monomer exciBueremission due lo proximity the【理fluo

11、rophorcsmonomer emission.signalingbindingRyhilindl5；ite图.9基于激基缔合物的芝出学传感器的工作原理杂原子对荧光的影响比较复杂，有时增强荧光，有时减弱荧光。主要 看杂原子化合物的结构。简单杂环化合物的荧光量子产率很小，几乎 为0，但当他们与苯环相并后的产物荧光大大增强。含氮杂环化合物 的分子中含有N原子。在非极性介质中它们的荧光很弱，随着介质 极性的提高，其荧光强度亦随之提高。取代基的影响取代基的性质对荧光体的荧光特性和强度均有强烈影响，芳烃和杂环化合物荧光光谱和荧光产率常随取代基而改变，取代基对荧光体的激 发和发射光谱以及荧光效率的影响规

12、律和机理，是人们甚为光注的领 域，可惜人们对激发态分子的性质了解甚少，影响规律多出自实验总 结和猜测。（a）推电子取代基增加荧光 属于这类基团的有O环外的前几或氨基上的非键电子（n电子）激发转移到环上而产生的。 由于他们的n电子云几乎与芳环上的轨道成品活性，实际上共享了共 轭而电子结构，扩大了共轭双键体系。因此，这类化合物的吸收光谱 与发射光谱的波长，都比未取代的芳族化合物的波长长，荧光效率也 提高很多，但在应用这类荧光体是要特别小心，因为这类基团都含有 未键和的n电子。他们容易与极性溶剂生成氢键。当取代基是酸基或 碱基是，在酸碱性介质中容易转化为相应的盐或质子化，使荧光强度 减弱甚至消失。（

13、b）吸电子取代基含有吸电子基团的荧光化合物，其荧光强度一般都会减弱，属于这类 取代基的有羰基 卤素和 基 等，这类取代基也含有n电子，然而其m电子的电子云并不与芳环 上的n电子云共平面，这类化合物的n n *跃迁是属于禁戒跃 迁，摩尔吸收系数很小（约为102），最低单线激发态S1为n，n *， S1 的系间跨越强烈，因为荧光强度都很弱，而磷光强度相 应的增强。氰基是一个很有意思的基团，是不饱和的取代基，它应使取代的化合 物的荧光减弱，但实际结果是表现为退电子的效果一一荧光强度。它 的取代9, 10-二氰基蒽的f不但大于蒽，而且9-氯-10-二氰基蒽的 f也高达0.95，远大于9-氯代蒽的f (

14、0.11)(C)重原子的取代荧光体取代上重原子之后，荧光减弱，二磷光往往相应增强。所谓重 原子取代，一般指的是卤素(Cl,Br和I)取代芳烃取代上重原子后荧 光强度一般随卤素原子量增加而减弱，这一效应称为“重原子效应”。 这种效应被解释为：由于重原子的存在，使得荧光体中的电子自选一 轨道偶合作用加强、S1T1的系间跨越显著增大，结果导致荧光强度极爱你若、磷光强度增加。饱和烷烃的取代此类取代基对荧光体的荧光强度影响不大，可是，由于可动的饱和 烃基的引入，增加了荧光体的振动和转动自由度，因而消弱了荧光激 发光谱和发射光谱振动结构的分辨率，同时激发峰和发射峰略为红 移。取代基数量及其所处位置的影响取代基在试剂分子上的位置及取代基的数量对试剂的荧光量子产率 的影响视具体情况而定，是有一个退电子取代基，处于空间位阻最小 火空间位阻的位置可使荧光增强。对于不同的发光母体，同类取代基 所处位置不同所表达的荧光强度变化规律也不相同。另外对荧光的影响还要看取代基的种类，校体积取代基所贡献的共轭效应小，只是体现出其电荷影响，若一个大的取代基如苯或乙炔基苯 其共轭效应大，取代后扩大了试剂共轭体系，使荧光增强的效应大于 其吸电子是荧光减弱的效应，结果是取代后荧光强度不是减弱二十大 大增强。（f）芳香环中杂原子的影响杂原子对荧光的影响比较复杂，有时增强荧光，有时减弱荧