挥发性脂肪酸VFA测定步骤与方法

1、挥发性脂肪酸的测定一、GC （ Gas chromatograph ）工作条件仪器：GC-14B型气相色谱仪（日本岛津公司）毛细柱：NUKOLTM CapillaryColumn （ Supelco ） ； ColumnNO.34292-07B30mX 0.32mmX 0.25 阿 film thickness气相色谱仪参数：色谱柱采用毛细吸管柱，柱温130 C,汽化温度180 C,采用氢离子火焰检测器，检测温度180 C,载气为氮气，压力为60 KPa，氢 气压力为50 KPa，氧 气压力50 KPa，灵敏度（档）为101，衰减3.0二、样品制备试剂制备（1）配制25%w/v的偏磷酸溶液，将

2、25g偏磷酸溶在100mL双蒸 水中（2）巴豆酸的配制，在100ml的偏磷酸溶液中加入0.6464g的巴豆 酸，定容到 100mL。（可先用80 ml双蒸水，加热溶解偏磷酸，然后定容至100 ml）（3 ）标准样品，准确称取色谱标准级乙酸0.9100 g、丙酸0.3700 g、丁酸0.1765 9、异丁酸0.1765g、戊酸和异戊酸分别为0.1985g，分别溶于双蒸水中，再各自 定容至100 mL。样品制备（1）发酵液取（或过滤瘤胃液）VFA测定1ml样品到离心管中，再加入0.2 ml的偏磷 酸巴豆酸混合溶液，-20 C冰箱保存过夜，解冻后12000rpm离心5min，取上清 液保存，测 定前

3、再12000rpm离心5mi n（或少许通过0.22 Am针式滤器，滤液直 接进样用1.0微升微量进样器瞬时注入色谱仪，进样量为0.2 1.0 AL。（2）食糜及粪样VFA测定 取1g置于离心管中，加入5 10倍的双 蒸水，混合均 匀。取1mL上清夜，加偏磷酸巴豆酸0.2mL/mL。其 它步骤同上。保留时间的确定与样品处理相同，在1 ml标准样品中加入0.2mL偏磷酸与巴 豆酸的混合样， 上样测出乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸和异戊酸的保留时间。有机酸浓度的计算通过标准样品和内标巴豆酸各自的（或浓度）和峰面积可以计 算出乙酸、丙酸及丁酸等有机酸的相对校正因子，然后根据乙酸、丙酸及丁酸的重量（或

4、浓度）与其 峰面积成正比计算出各个样品中的乙酸、丙酸及丁酸浓度。（样品某酸峰面积值X巴豆酸标样峰面积X某酸标样浓度）某酸浓度（mM）=（样品中巴豆酸面积值X标样某酸峰面积）挥发酸标样的质量和换算的浓度标样浓度质量 /g/100mL分子量浓度/mMnIm 一 一而八0.646486.0975.08421乙酸酸0.924660.05153.9717丙酸0.3/1374.0850.12149酸0.178788.1120.28147异酸0.17488.1119.74804戊酸0.1904102.1418.64108异戊酸0.205102.1420.070495.有机酸重现率将某有机酸（如乙酸）连续上样

5、几次，测定其峰面积值，利用某酸峰面积值和内标峰面积值计算其重现率。乙酸重现率变异系数：1.28720.06404丙酸重现率变异系数：0.51040.01961丁酸重现率变异系数：0.34220.01037异丁酸重现率变异系数：0.4668 0.01447 戊酸重现率变异系数：0.143 1 0.01754 异戊酸重现率变异系数：0.1671 0.034966.不同标样有机酸的GC峰形丙酸&丁酸异丁酸样品混合标样标样的分子量和出峰时间沸点分子量出峰时间巴豆酸86.091.95min乙酸118 C60.050.87min丙酸141 C74.081.0min丁酸163.5 C88.111.2min异演154.5 C88.111.06min戊酸102.141.68min异戊酸102.141.38min气相色谱的气体工作三条件（VFA测定）钢瓶减压阀压力气象色谱压力表氢气0.14MPa50KPa空气（AIR1）0.