膜片钳实验技术

1、脑片膜片钳实验方法文献综述一1966年，Yamamoto和McIlwain首次在脑片上记录了电生理活动(1966a, b),证实了脑组织在体外也能存活， 并保持很好的活性状态。此后，该方法在生理学研究中的应用越来越广泛，并为中枢神经系统生理和药理 学领域突飞猛进的发展奠定了基础。1989年，Blanton将脑片电生理记录与细胞的膜片钳记录结合起来， 建立了脑片膜片钳记录技术，这为在细胞水平研究中枢神经系统离子通道或受体在神经环路中的生理和药 理学作用及其机制提供了可能性。在脑片电生理记录中，实验者可以按不同的实验目的直接准确地改变脑片灌流液的成份和条件，如温度、 酸度和渗透压、通氧状态、以及离

2、子通道或细胞信号转导通路的阻断剂等；另外，实验者还能借助显微镜 准确地放置记录电极和刺激电极，同时，可借助一些特殊的加药装置，将一定浓度的药物加到整个脑片或 是脑片上的特定区域上，研究电信号沿神经环路的传递规律。在电生理学实验结束后，活性较好的脑片还 可用于生物化学或解剖学的分析。这些优点使实验者能获得准确的神经生理学的研究结果，也是其应用较 在位大脑广泛的原因所在。海马脑片是中枢神经系统研究中应用最为广泛标本之一。其原因有以下几点：1、海马与脑的其它部位相对 隔离，较易剥离，且剥离后受到的损伤较小；2、海马具有高度分化的片层结构，一方面，海马神经环路在 片层中的分布有一定的空间规律，如锥体细

3、胞胞体分布在锥体细胞层，而雪氏侧支突触分布于辐射层，且 海马中存在一个三突触联系的回路，即穿通纤维-齿状回颗粒细胞层、苔状纤维-CA3区锥体细胞层、雪氏 侧支-CA1区锥体细胞层等，因此，在海马中可以较准确地记录到特定神经元或突触的反应；另一方面，这 种板层结构有利于解释在某一部位记录到的细胞外场电位的意义。这些都使海马成为电生理学研究的理想 标本。本文对海马脑片膜片钳的操作规程及注意事项总结如下。一、海马脑片的制备脑片制备中，海马分离应在断头后10分钟内完成，56分钟为宜。在分离海马时，还应注意不要扭转或撕 扯海马，更不要损伤海马。分离海马的速度和质量是保证海马脑片制备成功的关键所在。评价脑

4、片活性最简单的方法是记录脑片上的群峰。在一个状态良好的脑片上记录到的群峰在一个很宽的刺 激强度范围内始终是单峰的。出现多个群峰往往提示抑制性突触功能已受损，这是脑片最早的病理生理学 改变。如果仅存在突触前纤维群峰(Fiber Volley, FV)，或FV峰大于突触后反应，这提示脑片活性极差，有 活性的突触已所剩无几，为激发突触反应需要更多的突触前纤维参与，需中止实验。在活性较好的脑片中， FV峰几乎探测不到，或远远小于突触后反应。有时会莫名其妙地出现一些问题，突触标本中突触后神经元看上去状态良好，但做了很多天甚至几周都没 有得到有用的数据。在这种情况下，须要耐心地思考失败的原因，并设法解决。

5、首先，应该检查溶液，用 其它实验室制备的标本或更换实验动物。对于脑片的制备而言，切片机出现的机械故障会损坏脑片的质量。 总之，在实验的全过程中能尽量注意每一个细节问题，出现问题后反复尝试，实验就会容易起来。二、海马脑片的膜片钳记录1、将刺激电极放置在含突触前纤维脑片区域附近在突触传递的研究中，应该同时记录突触前和突触后神经元的电信号，虽然，并不是所有突触前神经元胞 体的动作电位均可传导至突触(Vincent, 1996)。由于在突触前和突触后两个神经元上同时做膜片钳记录较 困难，因此，需要用其它的方法来诱发突触前动作电位的发放。用刺激电极可在单个或多个突触前细胞或 轴突诱发动作电位。另外，还可

6、以用局部施加神经递质的方法来诱导动作电位，如用短促的压力、离子电 泳或笼锁谷氨酸光解等方法将谷氨酸加到突触前胞体或轴突上，可以诱导出多个动作电位。用电极刺激 在神经元培养皿中，可以用连接了电源(通常是膜片钳放大器)的微电极直接刺激突触前神经 元。在这种情况下，通常需要用负压吸引使突触前的细胞贴紧刺激电极，防止刺激电流的逸出。通过膜片 钳放大器给脉冲刺激的优点是，它可以记录到突触前细胞被激活的胞外电信号(Role, 1987)。从培养的神经 元和脑片上找到有突触联系的一对神经元是很困难的，但在神经元培养中有单个神经元的Autapic突触就 会方便许多。可以用膜片钳电极或尖端较细的一对钨电极给突触

7、前轴突纤维施加电压脉冲。用电极刺激可将Ag/AgCl电 极置于孵育槽中与其构成一电流回路。刺激电流一定要与膜片钳放大器记录电路隔离开，以防止刺激电流 漏入记录电极中，而使刺激尾迹变得很大。为此，施加刺激需要一个未接地的隔离器。隔离器可以用外界 脉冲刺激或计算机来控制。另外，还需要将刺激尾迹缩小到最小，以排除其对突触信号起始段的干扰。为 达到该目的，需将刺激电路的回路电极置于合适的位置或用膜片钳放大器提高串联电阻补偿的效率。刺激电极的位置通常将刺激微电极或刺激电极置于突触前轴突通过的部位。但有时突触前轴突在制备脑 片时即被去除。如果脑片制备时局部神经环路被破坏，实验中就很难成功地记录到突触后电流

8、。实际上， 切脑片的角度是保存局部神经环路最重要的因素之一，合适的角度既可使突触后神经元保存完好，也可保 留部分较长的突触前纤维用于电刺激。用胞外电极刺激激活的神经纤维较多，而且，每次刺激激活的纤维 数目也会不同。如果实验目的是将不同的传导通路分开，那么，必须要证明两个刺激电极激活的纤维各不 相同。2、全细胞记录用可视化膜片钳寻找清楚、且表面光滑、折光性较好的突触后神经元。在加了正压后，将记录电极移入脑 片视野中，并接近事先选好的神经元，然后，调整电极与神经元的相对位置，利用负压形成稳定的高阻封 接。用短簇的脉冲负压使细胞破膜，稳定23分钟，观察封接测试波形起始段与基线间的差值是否在100pA

9、 以内，封接电阻是否大于200M，如果是，且较稳定，再迅速补偿串联电阻和慢电容，舍弃串联电阻大于 30M的细胞，且在记录过程中监测串联电阻的变化，当变化大于20%时，中止记录。如果细胞状态不好， 就马上重新制备脑片，以提高实验效率。3、判断突触前纤维在记录电刺激的突触反应时，可以验证刺激电极是否放置在突触前神经元或轴突上，在实验中，如果记录 不到突触反应，说明刺激电极位置不正确，这时可以稍微移动刺激电极的位置。如果还记录不到，这可能 还与组织片活性较差有关，可以更换组织片或改进切片角度加以解决。电刺激方波时程一般设定为 0.10.2ms，恒流条件下刺激强度一般为0.13mA，恒压条件下刺激强度

10、为540V.4、突触反应的判断及其波幅稳定性的评价突触信号的判断 突触信号样的假象波有三个来源。第一、邻近纤维的活动使静止细胞产生电压波动；第 二、如果恒流刺激强度过大，电流就可被注入突触后神经元，使其产生失活时间类似EPSP或EPSC的信 号，其信号幅度随刺激强度的变化而变化；第三、直接刺激突触后神经元诱导出突触样的动作电位，这种 反应紧接着刺激尾迹发生，没有翻转电位，使突触后神经元膜电位超极化和向记录电极内液中加入10mM 的QX-314，均可避免突触后神经元产生动作电位。但QX-314可阻断多种突触激活的通道(Otis, 1993)，在 某些情况下它还可以增加漏电流。多突触激活通常情况下

11、，刺激电流可激活多个突触前纤维，在突触后可记录到多种突触信号。因此，有 必要用一些选择性阻断剂阻断一些不在研究范围内的突触活动。而且，刺激一束纤维，通常可激活多个同 种的突触前纤维。不同的刺激强度下，被激活的突触前纤维数目不同，从而引起的突触反应也会不同。因 此，要仔细调节刺激部位和刺激强度以便能刺激到单一的轴突(Stevens, 1995; Zhang, 1994a)o胞内刺激突触 前细胞是刺激单个轴突最好且最稳定的方法。甚至在单个突触前神经元被激活后，在突触后记录到的反应也是由多种神经递质共同作用的结果。多突触 活动是突触活动的叠加效应，这包括去极化和超级化反应。在一些标本中，这是不可避免

12、的。通常可用药 物阻断不在研究范围内的突触活动。提高灌流液中钙镁等二价阳离子的浓度至5mM，以增加动作电位的阈 值，就可以有效地减少多突触活动。通常情况下，突触反应是否来自单突触可以根据如下条件来判断：潜 伏时在0.51.5ms的范围内，高频刺激时突触反应立即消失，突触反应的上升支和下降支较平滑，且无长 潜伏时成份(Berry, 1976)。电刺激引起的突触反应波幅在一定范围内的波动是一种正常现象，但记录过程中有电流衰减发生，当记录 过程中电流衰减大于1015%，就必须中止实验。如果电流衰减不可避免，就需记录较长时间确定电流衰减 的速度。低频刺激(0.11Hz)下，记录几分钟，观察突触反应波幅

13、的相对稳定性。电极内液成份与受体敏感性 在形成全细胞记录后，胞内成份会被电极内液成份所稀释而发生改变，但在 10分钟内即可达到平衡。因此，要记录G蛋白耦联受体的活性时，应向电极内液中加入10100uM的 GTP(Trussell, 1987)。离子通道耦联的NMDA和GABAA受体的特性在全细胞记录过程中也会随时间的变 化而衰减。在记录时可用多种方法来避免或减小其衰减，如提高电极内液EGTA的浓度或用BAPTA等快 速络合剂代替EGTA，使胞内钙浓度远远低于1M；向电极内液中加入mM级的ATP；采用穿孔膜片钳记 录等。另外，电极的串联电阻小于10MQ或突触距胞体较近时受体的敏感性会很快下降。电

14、压钳制是否准确 在电压钳制不足的情况下，记录突触后电流，虽然，可以为突触药理学和突触效能的 活动依赖性的改变提供很有用的信息，但这些数据不能用于突触后电流幅度和时程的准确估计。那么，我 们如何判断每次记录时电压钳制的质量呢？如果突触后电流来自树突远端，那么，该突触后电流的钳制质 量就较低(Silver, 1996)。另外，还有一些判断钳制质量的方法，如突触电流的上升时间较长(如AMPA受体 电流的上升时间大于1ms)；在某一突触后电流的翻转电位下可见到双相的突触后电流等。评价电压钳制质量最常用的方法就是在一次记录后，绘制上升时间对下降时间曲线图。如果上升和下降时 间被树突过滤过，则该曲线呈正相

15、关关系，上升或下降时间与幅度间就会呈负相关关系。总之，上升时间 受树突过滤的影响要远远大于下降时间。因此，如果随上升时间的变化，下降时间变化较小，这种情况下 的下降时间是可靠的(Hestrin, 1990)。需要注意的是，上升时间与下降时间相关性较差并不足以判断电压钳 制的质量。Johnston等对树突上突触反应的钳制效果做了深入的讨论(Brown and Johnston, 1983; Spruston, 1993)。Husser (1997)等建议用突触电导随钳制电位的变化来检测树突突触反应的幅度和动力学特性。在突触后电流较大时也存在钳制的偏差。这时，由电极串联电阻引起的电压降会影响到突触

16、后电流的幅度 和形状。若想验证是否存在这个问题，可以向灌流液中加入少许受体的高亲和力的阻断剂，观察突触后电 流的时程是否会随其峰值的下降而变化，因为，受体的阻断不会改变其动力学特性(Otis, 1996; Zhang, 1994b)；另外，可以改变串联电阻补偿的水平，观察在不同的补偿水平下突触后电流会不会改变(Llano, 1991; Takahashi, 1995)。在许多情况下，有可能在发现偏差后更正突触后电流的下降时间。值得注意的是，串联 电阻可以带来其它的偏差，如对波形的滤波效应。盲法膜片钳记录中，串联电阻通常要大于10MQ，因此， 这种影响是不可避免的。但可以用公式1/(2pRser

17、iesCM)计算记录系统的过滤水平，确定突触后电流峰值和 形状受影响的程度。5、突触反应的记录现在许多实验室都开始应用膜片钳技术记录培养神经元间、组织片中和异体移植组织中的突触传递。与尖 电极记录相比，它具有明显的优势。如，记录的成功率较高，较高的信噪比，能较准确地钳制胞电位等。 膜片钳甚至可以应用于在位突触活动的记录(Covey, 1996)。记录自发突触后反应自发的突触后反应有两个来源。一是局部神经环路中动作电位发放引起的递质释放， 另一个是突触囊泡中递质的自发释放，后者被称为微突触反应(miniature synaptic event)。由于动作电位依赖 性的自发突触反应幅度与微突触反应

18、差别并不大，因此没有必要将两者区分开来。为记录到很纯的微突触 反应，可以用TTX来阻断动作电位依赖性自发突触反应，另外，去除灌流液中的钙或向其中加入钙通道阻 断剂镉，即可以阻断电刺激诱发的递质释放。但如果多个囊泡在同一个突触末梢中同步释放，则以上两种 方法的效果就不同了 (Korn, 1994)。自发性突触活动的发放频率通常小于几Hz。发育期标本上，自发性突触活动的频率就非常低(Edwards, 1990)，因此，需要记录较长时间才能获得足够用于分析的突触反应。如果自发性突触反应的频率很高，多 个突触的反应就会重叠在一起，就不能通过上升或下降支的时间来判断是单个突触反应或是多个突触反应 的叠加

19、，从而，给数据分析带来许多麻烦。突触反应的频率受温度的影响较大(Fatt, 1952)，因此，在特定 的实验中，可以通过调节灌流液的温度来调整合适的突触反应频率。局部施加去极化或超极化溶液也可以 诱发自发突触活动(Bekkers, 1992; Tang, 1994)。在一些标本中，在刺激诱发的突触反应之后，自发性突触反 应的频率会显著增高，在含有锶的灌流液中尤其如此(Dodge, 1969; Goda, 1994)。这一事实可用于检测与特 定突触活动相关的量子大小(Otis, 1996)。数据采集突触反应可用计算机软件通过特定的采集卡采集到计算机硬盘上。记录电刺激的突触活动时， 还须用计算机产

20、生一个TTL脉冲以激活刺激器，并由隔离器经刺激电极刺激突触前纤维。所需的数据量电刺激所诱导的突触信号的记录中，其数据量取决于信噪比和信号的变异度。对电刺激诱 导的全细胞电流记录而言，高信噪比不是问题，但在记录自发突触信号时，信噪比就变得比较重要了。实 验前最好做预实验，估计获得准确的均数所需记录的信号数。当然，也应了解给定的刺激频率下突触信号 的稳定性。对于电刺激诱导的突触信号，其峰值的变异系数较小，因此，以0.1Hz的刺激频率记录510次 就足够了。对于自发性突触信号来说，信号峰值的变异度较大，通常大于20%，为得到较可靠的结果往往 需要记录100个以上的信号。实际上，要得出准确的变异，往往

21、需要记录成百上千次信号，这也是得到较 可靠的信号峰值分布规律的必要条件。在低频刺激下记录突触信号时，要控制系统误差，使记录保持稳定， 须要制备活性较好的标本，并要有配套的稳定的实验条件。精确的测量控制是保证实验数据可靠性的基础， 而且，每次实验都要对其进行严格的评价。6、突触反应的分析刺激诱发的突触反应的分析突触反应的大小和形状突触电流和电位的检测指标有潜伏时(latency)、峰值(amplitude). 1090%上升时间 (1090% rise time)、1/2 峰值时的波宽(half width)、失活的指数拟合时间常数(exponential decay curve)(图 1)。

22、潜伏时是刺激尾迹(stimulus artifact)的起始时间到突触电流或电位峰值的5%间的时间间隔(Zhang, 1994a), 潜伏时包括几部分的延迟：突触前轴突发放和传播动作电位的时间、神经末梢去极化到递质释放的突触延 迟、递质扩散到突触后并引起受体激活的时间。由于递质扩散和受体激活的速度相当快，因此，突触延迟 是突触前神经末梢发放动作电位和出现突触后反应间的时间间隔(Isaacson, 1995; Katz, 1965; Zhang, 1994a)。 突触反应的幅度是其峰值与反应前基线间的差值。信噪比较低时，须要计算突触反应前多个点和突触反应 峰值前后多个点的均值，然后，以它们间的差

23、值作为突触反应的幅度。上升时间用从峰值的10%到90%的 时间描述较为准确。由于潜伏时的存在，很难判断突触反应开始的时间和到达峰值的时间。当刺激尾迹严 重地干扰了突触反应起始的判断时，也可以用2080%上升段的时间来描述上升时间。突触反应时程可以用 以下几种方法来描述：1、1/2峰值间的时间，它包括了上升时间和下降时间；2、突触反应的下降支经多种 指数拟合(如单指数拟合、双指数拟合和多指数拟合)产生一个或多个时间常数(decay time constant) o 双脉冲易化(paired pulse facilitation, PPF)，即以较短的间隔重复刺激突触前纤维两次，第二次刺激诱发的突

24、 触反应大于第一次刺激的现象，这是一种突触前现象，它可反映突触前递质释放概率的变化。最小刺激诱发的突触反应记录最小刺激(仅能激活一个或少数几个突触前纤维的刺激)诱发的突触反应可 用于估计量子的大小，这种刺激有时可以诱发突触反应(success)，而有时则不能(failure)，其诱导出的突触 反应的均值可用于估计单个量子的大小。可分析电刺激诱发的突触反应的软件有许多常规软件均可用于突触反应的分析，如Axon公司开发的 pClAMP软件包，WaveMetrics公司开发的Igor Pro等，均可用于电刺激诱发的突触反应的分析。自发性突触反应的分析突触反应的检测目前有三种方法判断自发性突触反应(Hwang，1999)。第一、峰值超过即定阈值，该方法 受基线波动的影响较大，这可以通过基线加以弥补；第二、峰值相对于基线的变化量超过阈值，它受高频 噪声的干扰较大，而且，很难设定一个合适的阈值，为克服这些不足，可以在处理时对原始数据进行滤波 处理，除去高频噪声；第三