细胞壁缺陷结核分枝杆菌耐药性的基因研究

1、细胞壁缺陷结核分枝杆菌耐药性的基因研究王和罗振华徐艳梁菁苹【摘要】目的检测与阐发细胞壁缺陷结核分枝杆菌的耐药性相干基因，探究细胞壁缺陷结核分枝杆菌耐药性的基因基矗要领别离分散16株自觉形成和用利福平、异烟肼、乙胺丁醇诱导形成的结核分枝杆菌的染色体DNA，PR扩增IS986序列以及rpB、katG和ebB基因后举行凝胶电泳和序列阐发。效果自觉形成及抗结核药物诱导形成的结核分枝杆菌不变L型可在含利福平(4g/l)、异烟肼(0.2g/l)、乙胺丁醇(7.5g/l)的造就基内生长与传代造就。基因检测与阐发表现，结核分枝杆菌不变L型仍旧保存IS986基因，rpB、katG、ebB基因也未见突变。结论结核

2、分枝杆菌不变L型可自觉形成，也可被利福平、异烟肼和乙胺丁醇诱导形成。结核分枝杆菌不变L型对利福平、异烟肼、乙胺丁醇形成耐药性，但其染色体上耐药相干基因并没有产生突变。除染色体耐药相干基因突变可造成结核分枝杆菌形成耐药性外，细胞壁缺陷也是造成结核分枝杆菌形成耐药性的一个紧张机制。【关键词】结核分枝杆菌；细胞壁；基因；耐药性KEYRDSybateriutuberulsis;ellall;Gene;Drugresistane细胞壁缺陷是结核分枝杆菌最常产生的变异征象之一，被以为是结核分枝杆菌生命周期奇特的一个形态时期或相1。然而比年的研究2创造，结核分枝杆菌不但可在人工造就基及动物体内天然产生细胞壁

3、缺陷变异，而且也可在利福平、异烟肼和乙胺丁醇等抗结核药物的诱导下产生细胞壁缺陷变异以及在含高浓度抗结核药物的造就基内传代造就。文献3报道，结核分枝杆菌耐药性的形成重要同其染色体上耐药性相干基因突变有关，尚未创造质粒等其他细菌所具有的耐药性机制。为探究细胞壁缺陷导致结核分枝杆菌形成耐药性的基因机制，本文接纳基因检测与阐发的要领，对自觉形成和抗结核药物诱导形成的细胞壁缺陷结核分枝杆菌的耐药性相干基因举行了检测与阐发，现将效果陈诉如下。1质料与要领1.1质料(1)菌株16株结核分枝杆菌(ybatiutuberulsis)别离为质控菌1株(H37Rv，R#934，编号93009)，中国药品生物成品检定

4、所提供，本室编号k；临床分散菌15株，获自贵阳市肺科病院住院肺结核患者痰标本，本室编号115。(2)造就基苏通造就基，按文献4要领制备。(3)诱导剂利福平胶囊(rifapin，RFP)，批号：国药准字H21021905，沈阳红旗制药提供；异烟肼片(isniazid，INH)成都锦华药业提供，批号H51020788；乙胺丁醇片(ethabutl，EB)批号010101，成都锦华药业提供。(4)结核分枝杆菌基因检测试剂盒扩增结核分枝杆菌染色体DNA重复守旧序列IS986，引物碱基序列为5-GTGAGGGATGAGGTGG-3，5-GGTAGGGTGGTGAAAA-3，扩增产物分子量为245bp。华

5、美生物工程公司提供，批号20220501。(5)结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒rpB基因检测试剂盒扩增序列涵盖rpB基因的第507至533位暗码子，rpB基因外衣引物碱基序列为rpBP1：5-GTGGAGGGATAAGA-GAGTT-3，P2：5-AGTGGAGGGTGAGT-GGGAT-3，扩增片断215bp；内套引物碱基序列为rpBP3：5-GTGGAGGGATAAGA-GAGTT-3，P4：5-GATAGGGAG-TAT-3，扩增片断193bp，无锡市克隆遗传技能研究所提供，批号050613。katG基因检测试剂盒上游引物5-AGTGTATGGAGGAA-3，卑劣引物5-TTGATAGA

6、TTG-3，扩增katG基因904、1523bp(620bp)，扩增片断为katG基因突变热门区，包罗315、321、381、406、409、418、441、456、463和476位，无锡市遗传克隆技能研究所提供，批号050613。ebB基因检测试剂盒ebB基因外衣引物的碱基序列为E15-GGTGATGTGGGG-3、E25-GATAAGATGGGTGTG-3，内套引物E35-GGATGGGGTGATT-3、E45-TATAGGAGAGGTTGTAA-3；E1、E2引物扩增ebB基因自77218002共282bp碱基序列，E3、E4引物扩增ebB自77417973共233bp碱基序列，第二次扩

7、增的片断包罗ebB的突变热门区，即第285位、306位、和330位共77个暗码子(233个碱基)，扩增产物分子量为233bp，无锡市遗传克隆研究所提供，批号别离为021211、031013、030610、040503。(6)PR产物纯化试剂盒UltraleanPRlean-upKit，美国BI公司提供。(7)PR测序试剂BigDyeTerinatrKit，美国PE公司提供。1.2要领(1)菌种断定用BATE-TB460检测体系以及结核分枝杆菌基因检测试剂盒保举的要领，对各菌株别离举行菌种断定，染色体IS986序列PR扩增与检测，RFP、INH和EB敏感性测定以及rpB、katG和ebB基因的P

8、R扩增与序列阐发。(2)不变L型诱导与分散按照各菌株的药物敏感性及其耐药相干基因检测效果，选择rpB基因未产生突变的k、4、5菌株和突变的13菌株，katG基因未产生突变的15菌株和突变的5、8菌株以及ebB基因未产生突变的2、4、5、6、7、8菌株。按文献2要领将各菌株别离接种于不含药物的苏通造就基，将rpB未突变菌株接种于含RFP0.1、0.2、0.4g/l以及突变菌株接种含RFP1、2、4g/l的苏通造就基；将katG未突变及突变菌株接种含INH0.005、0.01、0.02、0.04、0.08g/l的苏通造就基，将ebB基因未突变菌株接种含EB1、2.5、5、7.5、10g/l的苏通造

9、就基，置平凡温箱内37造就和分散L型。(3)不变L型断定按上述菌种断定的要领，别离提取各菌株自觉形成和诱导形成的L型的染色体DNA，举行IS986序列PR扩增与检测。(4)不变L型药物敏感性检测取自觉形成及RFP、INH、EB诱导形成的结核分枝杆菌不变L型纯造就物，别离接种于含差异浓度RFP(1、2和4g/l)、INH(0.2g/l)及EB(7.5g/l)的苏通造就基内，置平凡温箱内37造就并逐日在显微镜高倍镜下不雅察L型生长环境。与不含药物的比较组比力，断定L型的RFP、INH、EB敏感性。(5)不变L型耐药性相干基因检测按照结核分枝杆菌rpB、katG、ebB基因检测试剂盒保举步伐，别离提

10、取自觉形成及RFP、INH、EB诱导形成的不变L型染色体DNA举行PR扩增和2%琼脂糖凝胶电泳及紫外检测仪不雅察。rpB、katG、ebB基因的PR扩增产物别离纯化后，在主动测序仪上举行序列测定与阐发。2效果2.1结核分枝杆菌的药物敏感性k、4、5对RFP敏感，13对RFP耐药；5、15对INH敏感，8对INH耐药；2、4、5、6、7和8对EB敏感。各菌株均可检出IS986序列，耐药菌株可见相干基因的突变，敏感菌株未见基因突变(Tab.1)。2.2结核分枝杆菌不变L型2.3L型PR扩增产物k、4、5、8、13和15菌株的药物诱导形成及自觉形成的不变L型染色体DNA经PR扩增和电泳，可见形成与阳

11、性比较同等的分子量245bp的IS986序列条带。2.4L型的药物敏感性造就d14，k、4、5和13菌株自觉形成及RFP诱导形成的不变L型在含RFP为1、2和4g/l的培基内均可形成显着生长征象，每高倍镜视野最多可见30个L型细胞。5、8和15菌株自觉形成及INH诱导形成的不变L型在含INH0.2g/l的培基内均可形成显着生长征象，造就30d后每高倍镜视野最多可见27个L型细胞。2、4、5、6、7、8菌株自觉形成与诱导形成的不变L型在含EB为7.5g/l的造就基内均可形成显着生长征象，造就30d后每高倍镜视野最多可见25个L型细胞。2.5L型的耐药基因(1)PR扩增产物k、4、5和13菌株RF

12、P诱导形成及自觉形成的不变L型rpB基因nPR扩增后，琼脂糖凝胶电泳可见形成与阳性比较同等的分子量193bp条带；5、8和15菌株自觉形成和诱导形成的不变L型染色体DNA的katG基因PR扩增产物，可见形成与阳性比较雷同的620bp分子量条带；2、4、5、6、7和8菌株EB诱导形成及自觉形成的不变L型ebB基因nPR扩增后，琼脂糖凝胶电泳可见形成与阳性比较同等的分子量233bp条带(Fig.2Fig.4)。(2)PR产物的核苷酸序列k、4、5和13菌株RFP诱导形成及自觉形成的不变L型rpB基因扩增产物测序效果与细菌型同等；5、8和15自觉形成及异烟肼诱导形成的结核分枝杆菌不变L型的katG基

13、因扩增产物测序效果与其亲代细菌型同等；2、4、5、6、7和8菌株EB诱导.tuberulsis形成及自觉形成的不变L型ebB基因扩增产物测序效果与细菌型的同等，未创造新的突变位点(Tab.2Tab.4)。3讨论细胞壁缺陷变异是细菌细胞壁的合成受到按捺或其完备性受到粉碎，细胞丧失细胞壁布局或制止细胞壁合成的一种保存逃逸征象。由于细胞壁缺陷细菌在不含诱导剂的环境中经常可重新合成细胞壁而规复与其亲代细菌同等的种种性子，因此以为细胞壁缺陷变异属于非遗传性的形态变异5。然而比年的研究6证明，完全丧失细胞壁的不变L型经常难以重新合成细胞壁，从而成为可表达某些新的遗传性状的不变L型菌株。本文效果表现，细胞壁

14、缺陷结核分枝杆菌的细胞体积增大，重要表示为圆球、卵圆及不规矩形态。结核分枝杆菌不变L型在苏通造就基内可以或许以出芽方法生殖和传代造就，但生长速率较其亲代细菌型显着迟钝。细菌的耐药性变异是细菌最常见的变异征象，细菌耐药性的形成与转移对临床治疗可产生严峻的影响。文献5以为，细菌耐药性的形成既可以由于抗性基因转移或突变所致的遗传性机制，也可以由于细菌代谢活性低落、丧失抗菌药物作用的靶位以及抗菌药物不克不及穿过细菌寄生细胞的膜所致的非遗传性机制。细胞壁缺陷造成细菌丧失了抗生素作用的靶位，因此可对青霉素等滋扰细胞壁合成的抗菌药物形成非遗传性耐药性。本文效果表现，岂论自觉形成照旧抗结核药物诱导形成的结核分

15、枝杆菌不变L型均表示出相似的利福平、异烟肼和乙胺丁醇耐药性。接纳基因检测与阐发要领证明，这些不变L型不单仍旧保存了与其亲代细菌型同等的IS986序列，而且其染色体上耐药性相干的rpB、katG、ebB基因也没有产生突变。提示细胞壁缺陷并不合错误结核分枝杆菌染色体上IS986序列以及耐药相干基因产生影响，其所导致结核分枝杆菌形成的利福平、异烟肼和乙胺丁醇耐药性大概与细菌代谢活性以及某些代谢机制改变有关。结核分枝杆菌不单可由于染色体上耐药相干基因突变而形成遗传性耐药性，而且也可由于细胞壁缺陷及其所导致的代谢活性与机制改变而形成非遗传性耐药性。通常以为5，细菌在滋扰细胞壁肽聚糖合成或粉碎细胞壁布局的

16、抗生素等因素的作用下，可产生细胞壁缺陷和形成L型。但比年的研究6证明，细菌也可在天然生长生殖的历程中以及在滋扰其他代谢环节的因素作用下产生细胞壁缺陷和成为L型。抗结核药物的作用机制重要是滋扰卵白质、核酸、糖及脂的代谢，因此以为对举行活泼代谢运动的结核分枝杆菌具有显着的按捺或杀灭作用。利福平的抗菌机理是按捺依靠DNA的RNA多聚酶活性，制止结核分枝杆菌RNA的合成；异烟肼可以或许按捺分枝菌酸的合成，影响结核分枝杆菌细胞壁的布局；乙胺丁醇可滋扰阿拉伯半乳聚糖和脂阿拉伯甘露聚糖的合成，导致结核分枝杆菌产生细胞壁缺陷。本文效果表现，结核分枝杆菌不单可以或许在通例的苏通造就基内自觉形成L型，而且也可在利

17、福平、异烟肼、乙胺丁醇的作用下敏捷形成L型而且得到耐药性。提示结核分枝杆菌是轻易产生细胞壁缺陷的细菌，其可在很多因素的作用下产生细胞壁缺陷变异和成为L型。L型的产生使结核分枝杆菌敏捷形成对利福平、异烟肼、乙胺丁醇的耐药，如许不单可导致临床抗结核药物治疗无效，而且也可导致病原学查抄以及耐药性基因检测与阐发的漏诊或误诊，从而造成结核分枝杆菌在宿主体内暗藏存在和形成结核的埋伏带菌者与感染源。【参考文献】1LuJH,ZhangYH,ZhaK,etal.Bilgialsinediiene.BEijingPepleHealthPublishingHuse,1995,386389.2angH,hengZH.bservatinsfprpertiesftheL-frf.tuberulsisinduedbytheantituberulsisdrugsJ.hinJTuberRespirDis,(中华结核和呼吸杂志)2001,24(1):5255.3EspinalA,LaszlA,SnsenL,etal.GlbaltrendsinresistanetantituberulsisdrugJ.NEnglJed,2002,304(17):1294130