新基因功能研究的策略与方法课件

1、新基因功能研究的策略与方法随着生命科学的发展及研究领域的不断开拓和生物医学研究在分子水平上的不断深入和推进，越来越多的未知新基因和基因的新功能被发现,越来越多的新基因被得以成功克隆，因此对新基因功能的研究显得日益重要，这也是后基因组时代功能基因组学的重要研究内容和首要任务。一.新基因的生物信息学及体内表达规律分析;二.新基因的体内表达规律分析三.功能获得与功能失活策略研究;四.功能失活策略五.基因编码产物相互作用蛋白的研究基因功能的研究策略主要包括： 目前，生物信息学分析已成为新基因功能研究首选和必用方法，其具有方便快捷和经济等优点。研究者往往可以从中得到与新基因功能有关的重要信息，初步推测基

2、因的可能功能，进而制定出进一步的实验室研究方案。（1）编码产物预测分析（2）序列同源性分析（3）蛋白质功能域分析一.新基因的生物信息学及体内表达规律分析（1）mRNA水平的表达谱分析；（2）蛋白质水平的表达分析。二.新基因的体内表达规律分析 要开展新基因功能的研究工作，首要的研究任务摸清新基因在体内的表达规律。包括从mRNA和蛋白质两个水平上来对其基因表达谱进行分析，即看其在各种不同的正常或病态组织细胞中是否表达以及表达的水平高低等.新基因在某一特定的正常组织细胞中的表达水平高往往提示其在其中发挥着重要作用，而新基因在相应的病态组织中的表达异常则提示与该病理过程相关的生物学意义。四.功能失活策

3、略 通过观察某一细胞或个体在新基因的功能部分或全部失活后的细胞生物学行为或个体表型遗传性状变化来鉴定基因的功能。常用的方法主要有基于核酸的基因沉默技术和基因敲除等（1）基因沉默技术（2）基因敲除五.基因编码产物相互作用蛋白的研究 细胞各种基本功能的完成离不开蛋白质之间的相互作用以及通过相互作用而形成的蛋白质复合物。因此，确定能够与新基因编码的蛋白质表达终产物相互作用的上下游蛋白质分子，也是研究新基因功能的一个十分重要的方面。目前常用的研究蛋白质相互作用的技术包括传统的基亲和分析而建立的免疫共沉淀技术和酵母双杂交系统.（1）免疫共沉淀技术（2）酵母双杂交系统规律分析Cs3亚基蛋白的计算机预测分析

4、序列同源性分析 包括核苷酸序列同源性分析和氨基酸序列同源性分析，这也是目前生物信息学技术中应用最为广泛的基本技术之一。主要采用BLAST和FASTA程序进行，即从已知的各种核酸和蛋白质序列数据库搜索与新基因对应的功能已知的高度同源基因和蛋白质，从这些已知基因和蛋白质的功能信息中来初步推测和判断新基因的功能。 同时，因为人类全基因组测序已经完成，所以以新基因的cDNA序列来对基因组数据库进行同源性比对，则可很方便地获得与其完全同源基因组DNA 序列及其染色体定位信息，而无需进行荧光原位杂交等基因染色体定位技术，进而还可通过分析其内含子、外显子序列及其调节位点，推测其可能的基因表达调控方式。即通过

5、此法确定了富含亮氨酸重复序列蛋白新基因的基因组DNA序列及其染色体定位。用expay软件分析氨基酸序列同源性蛋白质的结构功能域分析mRNA水平的表达谱分析 对新基因在mRNA 水平上的表达分析涉及到的技术有半定量RT-PCR 、实时定量RT-PCR 和Northern Blot 等。半定量RT-PCR方法具有简便、快捷和经济的特点，但其存在着精确度不高和不能进行绝对定量等缺点，多用于基因表达水平的快速初步分析。实时定量RT-PCR是近年来新发展起来的一种mRNA定量分析技术，因具有特异性更强、有效解决PCR污染和自动化程度高等的特点而被广泛应用，但其成本相对较高。Northern Blot历来

6、是在mRNA水平上对基因表达进行分析的经典技术，被各实验室广泛采用其不仅可以进行定量分析，而且还能够检测基因转录本的大小及种类，这也是RT-PCR技术所不具备的优势但Northern Blot操作较为繁琐，采用放射性标记时也存在放射性污染的问题。在实际工作中，需结合这两类方法同时进行，互为补充。另外，必要时也应考虑使用原位杂交技术来对新基因的mRNA在特定组织细胞内的分布进行定位观察。 另外，对于病态组织细胞而言，在mRNA和蛋白质两个水平上的新基因的表达分析，还可以提供其基因表达调控的大致规律，譬如是主要在转录水平还是在翻译水平上被调控的。不少研究表明，细胞内特定基因的mRNA水平变化和蛋白

7、质水平变化的一致性很差。基因转染技术 通过基因转染，即将目的基因转入某一细胞中通过观察细胞生物学行为的变化来认识基因的功能，是目前应用最多、技术最成熟的基因功能研究方法。 如经典的RAS癌基因的功能即通过转染NIH-3T3细胞而得以鉴定目前常用的基转染系统分为非病毒性表达系统和病毒性表达两种，非病毒性表达载体目前主要采用质粒，通过脂质体介导、电穿孔等方法使目的基因被宿主细胞摄取，然而，尽管这类表达系统具有操作简便、经济等优势，其也有不少局限性，主要问题是，不同细胞类型对外源DNA的摄取能力有所不同，尤其在初级未转化的细胞中几乎是无效的，而初级细胞对于观察基因的细胞转化活性等行为恰恰非常有用。然

8、而，病毒性载体，尤其是逆转录病毒载体的使用却能够很好的解决此问题，这类以病毒为载体介导的基因转移因其具有转染效率高、目的基因可稳定表达等优势而被广泛应用。转基因技术 利用转基因技术，则可将外源基因引入动物体内，建立携带并且能够遗传给子代的转基因动物模型，通过对转基因动物的表型分析研究外源基因的功能，目前已经运用转基因技术建立了数千种转基因动物，并且还可以通过在携带外源基因的载体上加上组织特异性启动子等手段，从而控制外源基因在特定的时间或特定的组织器官表达。利用转基因动物来研究基因功能的优势在于它是一个在活体水平上的多维的研究体系，可以从分子到个体水平进行多层次、多方位的研究。基因沉默技术 这类技术中最常用的主要为反义寡核苷酸（ASON）、核酶和RNA干扰（RNAi）技术。 然而，包括这3种技术在内的该类技术均具有诱导干扰素和其它细胞因子表达等非特异性效应，另外，它们也会因为作用与和靶分子序列相近的分子而产生脱靶效应，其中，ASON因使用剂量大，其非特异性效应最大；而RNAi的这两种副效应最小。基因敲除小鼠技术免疫共沉淀技术酵母双杂交系统 是一种基于转录重建而建立的研究生物大分子相互作用的简便而有效的研究方法。其最大优势在于它可以用已经克隆的基因从特定细胞的2HIE表达文库中“钓取”与其编码产物相互作用的蛋白质及相应基因序列。它检测的相互作用在体内发生，无需额外的纯化